Differentielle Antwort auf DNA-Schaden: Genregulation durch p53 und I kappa B zeta in Apoptose und Seneszenz
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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2013
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 9
1 EINLEITUNG 13
1.1 ZELLZYKLUS 14
1.2 DNA-SCHADEN-ANTWORT 17
1.3 DERTUMORSUPPRESSOR P53 18
ENTDECKUNG VON P53 18
DOMAENENSTRUKTUR VON P53 18
REGULATION UND AKTIVIERUNG VON P53 20
POSTTRANSLATIONALE MODIFIKATIONEN VON P53 21
P53 ISOFORMEN 22
P53 ZIELGENE 23
1.3.1 P63 UND P73 24
1.3.2 DAS P53 ZIELGEN CDKN1A/ P21 26
1.4 APOPTOSE 27
1.4.1 EXTRINSISCHER APOPTOSE-SIGNALWEG 28
1.4.2 INTRINSISCHER APOPTOSE-SIGNALWEG 29
1.4.3 DIE BCL-2-PROTEINFAMILIE 30
1.5 ZELLULAERE SENESZENZ 32
1.5.1 SENESZENZINDUKTOREN 33
1.5.2 CHARAKTERISTIKA SENESZENTER ZELLEN 36
WACHSTUMSARREST 36
MORPHOLOGIE 36
AKTIVIERUNG VON TUMORSUPPRESSOR-NETZWERKEN 37
SENESZENZ-ASSOZIIERTE SS-GALAKTOSIDASE AKTIVITAET 37
CHROMATINMODIFIKATIONEN 38
SENESZENZ-ASSOZIIERTER SEKRETORISCHER PHAENOTYP (SASP) 39
1 . 6 DERTRANSKRIPTIONSFAKTOR NF-KB 4 1
1.6.1 DIE HCB-PROTEINFAMILIE 42
1.6.2 AKTIVIERUNG VON NF-KB 4 5
1.7 ZIELSETZUNG 46
2 MATERIAL &. METHODEN 48
2.1 CHEMIKALIEN, REAGENZIEN 8I PLASMIDE 48
2.2 KONSTRUKTION DES EXPRESSIONSPLASMIDS PLNDUCER20-LKB^ 5 1
2.2.1 DAS PLNDUCER20-SYSTEM 5 1
5
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.2 POLYMERASE-KETTENREAKTION 52
2.2.3 INTEGRATION DER PCR-PRODUKTE IN DEN PENTR/D-TOPO-VEKTOR 53
2.2.4 TRANSFORMATION KOMPETENTER E. COLI 53
2.2.5 PLASMIDISOLATION 54
2.2.6 REKOMBINATION DES PENTR/D-TOPO-VEKTORS MIT PLNDUCER20 54
2.3 ZELLKULTUR 55
2.3.1 ZELLLINIEN 55
2.3.2 KULTIVIERUNG 55
2.4 TRANSFEKTION 56
2.5 TRANSFEKTION MIT SIRNA 56
2.6 GENERIERUNG STABILER ZELLLINIEN MIT DEM PLNDUCER20-SYSTEM 57
2.6.2 VIRUSPRODUKTION IN HEK293 FT ZELLEN 57
2.6.3 TRANSDUKTION VON MCF7 UND HELA ZELLEN 58
2.6.4 SELEKTION TRANSDUZIERTER ZELLEN MIT G-418 SULFAT 58
2.7 IL-LA STIMULATION 59
2.8 INKUBATION MIT ETOPOSID 59
2.9 SENESZENZINDUKTION 59
2.9.1 Y-BESTRAHLUNG 59
2.9.2 INKUBATION MIT BLEOMYCIN 59
2.9.3 ONKOGEN-INDUZIERTE SENESZENZ (MCF7-PLNDUCER20-HRAS VU ZELLEN) 60
2.10 INKUBATION MIT ANAKINRA 60
2.11 LUZIFERASE REPORTERGENANALYSE 60
2.12 PROTEINANALYTIK 62
2.12.1 GEWINNUNG VON PROTEINEXTRAKTEN 62
2.12.2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEXTRAKTEN MITTELS BCA-TEST 62
2.12.3 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 62
2.12.4 WESTERN BLOT 64
2.12.5 IMMUNDETEKTION 64
2.13 IMMUNFLUORESZENZ 65
2.14 ANALYSE DER GENEXPRESSION EUKARYOTISCHER ZELLEN 66
2.14.1 RNA-LSOLATION 66
2.14.2 DNASE I VERDAU 66
2.14.3 REVERSE TRANSKRIPTASE-POLYMERASEKETTENREAKTION (RT-PCR) 66
2.14.4 QUANTITATIVE PCR (QPCR) 67
2.14.5 QPCR SASP-ARRAY. 68
2.15 NACHWEIS SENESZENZ-ASSOZIIERTER (SA) SS-GALAKTOSIDASE AKTIVITAET 69
2.15.1 HISTOCHEMISCHE FAERBUNG 69
6
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
2.15.2 FLUOROMETRISCHE BESTIMMUNG 70
2.16 DETEKTION SEKRETIERTER PROTEINE IN ZELLKULTURUEBERSTAENDEN 7 1
2.16.2 FLUOROMETRISCHER BEADARROY 7 1
2.17 DNA-FRAGMENTIERUNGS-ASSOY NACH NICOLETTI 72
2.18 STATISTISCHE AUSWERTUNG 73
3 ERGEBNISSE 74
3.1 BAEK WIRD VON P53 UND P73 AUF PROMOTOREBENE REGULIERT 74
3.1.1 IDENTIFIKATION DREIER PUTATIVER P53 BINDESTELLEN IM BAK1 PROMOTOR
74
3.1.2 BAEK WIRD DURCH P53 AUF MRNA- UND PROTEINEBENE REGULIERT 76
3.1.3 P73 BINDET AN DEN BAK1 PROMOTOR UND TRANSAKTIVIERT DIE BAK1
GENEXPRESSION 80
3.1.4 BAEK UND BAX MODULIEREN DIE DNA-SCHADEN-INDUZIERTE APOPTOSE 82
3 . 2 IKB? MODULIERT DEN SENESZENZ-ASSOZIIERTEN SEKRETORISCHEN PHAENOTYP
(SASP) IN DNA-SCHADENUND ONKOGEN-INDUZIERTER SENESZENZ UNABHAENGIG VON
IL-LA 85
3.2.1 Y-BESTRAHLUNG INDUZIERT SENESZENZ IN MCF7 ZELLEN 85
3.2.2 INKUBATION MIT BLEOMYCIN INDUZIERT SENESZENZ IN MCF7 ZELLEN 90
3.2.3 Y-STRAHLUNG INDUZIERT SENESZENZ IN MEF ZELLEN 94
3.2.4 INKUBATION MIT BLEOMYCIN INDUZIERT SENESZENZ IN MEF ZELLEN 96
3.2.5 IKB? REGULIERT DIE EXPRESSION DER SASP-FAKTOREN IL-6, CXCLL UND
MCP-1 IN Y-BESTRAHLUNG- UND
BLEOMYCIN- INDUZIERTER SENESZENZ IN MEF ZELLEN 99
3.2.6 DIE UEBEREXPRESSION VON IKB( IN HELA ZELLEN ERHOEHT DIE
Y-STRAHLUNGS-INDUZIERTE IL-6 UND IL-8
EXPRESSION 105
3.2.7 DER KNOCK DOWN VON IKB^ VERRINGERT DIE IL-6 UND IL-8 MRNA
EXPRESSION IN BLEOMYCIN-INDUZIERTER
SENESZENZ IN MCF7 ZELLEN 106
3.2.8 DER KNOCK DOWN VON IKB? VERRINGERT DIE INDUKTION DER IL-6 UND IL-8
EXPRESSION IN ONKOGENINDUZIERTER SENESZENZ (OIS) IN MCF7 ZELLEN ... .
108
3.2.9 IKB? REGULIERT DEN SASP IN Y-STRAHLUNGS- UND BLEOMYCIN-INDUZIERTER
SENESZENZ UNABHAENGIG VON
IL-LA 1 1 2
4 DISKUSSION 121
4.1 BAEK WIRD VON P53 UND P73 AUF PROMOTOREBENE REGULIERT 121
4 . 2 IKB? MODULIERT DEN SENESZENZ-ASSOZIIERTEN SEKRETORISCHEN PHAENOTYP
(SASP) IN DNA-SCHADENUND ONKOGEN-INDUZIERTER SENESZENZ UNABHAENGIG VON
IL-LA 1 2 7
4.2.1 AUSBLICK 140
5 ZUSAMMENFASSUNG 143
6 ANHANG 145
7
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
7 LITERATURVERZEICHNIS..... 149
8 DANKSAGUNG 166
9 PUBLIKATIONEN 167
10 LEBENSLAUF 168
11 EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG 169
12 ERKLAERUNG ZUM EIGENANTEIL 170
8
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