Charakterisierung der plastidenkodierten Proteine Ycf4 und PsbN in Nicotiana tabacum:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERWEIS 8
T ABELLENVERWEIS 9
ABKUERZUNGEN 10
1 EINLEITUNG 12
1.1 AUFBAU DER CHLOROPLASTEN IN HOEHEREN PFLANZEN 12
1.2 BIOGENESE DER PHOTOSYSTEME 13
1.3 AUFBAU UND ASSEMBLIERUNG DES PHOTOSYSTEM 1 17
1.3.1 DAS PSI IN HOEHEREN PFLANZEN 17
1.3.2 PSI-ASSEMBLIERUNG IN HOEHEREN PFLANZEN UND GRUENALGEN 19
1.3.3 YCF4 - ESSENTIELLER PSI-ASSEMBLIERUNGSFAKTOR IN CHLAMYDOMONAS
REINHARDTII 23
1.4 AUFBAU DES PHOTOSYSTEM II 24
1.4.1 PSBN - EINE ECHTE PSUE-UNTEREINHEIT? 26
1.5 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 28
2 ERGEBNISSE 29
2.1 CHARAKTERISIERUNG VON AYCF4 MUTANTEN IN NICOTIANA TABACUM 29
2.1.1 INAKTIVIERUNG VON YCF4 IN NICOTIANA TABACUM 29
2.1.2 PHAENOTYP DER AYC/?-PFLANZEN 30
2.1.3 PHYSIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DER AJYC//-PFLANZEN 32
2.1.4 IMMUNOLOGISCHE ANALYSE DER THYLAKOIDKOMPLEXE IN AYC/^-PFLANZEN 34
2.1.5 IMMUNOLOGISCHE DETEKTION VON YCF4 AUS TABAK 36
2.1.6 EXPRESSION VON PSI-ASSOZIIERTEN GENEN IN AJ/C/-PFLANZEN 37
2.1.7 ENTWICKLUNGSABHAENGIGE AKKUMULATION VON PSI UND PSI-ASSEMBLIERUNGS
BZW. STABILITAETSFAKTOREN 39
2.1.8 LOKALISATION VON YCF4 41
2.2 UNTERSUCHUNG VON YCF4-INTERAKTIONSPROTEINEN 42
2.2.1 MARKIERUNG VON YCF4 MIT EINEM C- ODER N-TERMINALEN EPITOP 42
2.2.2 PHAENOTYP DER TRANSPLASTOMISCHEN LINIEN MIT MARKIERTEM YCF4 45 3
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IMAGE 2
2.2.3 DETEKTION DES MARKIERTEN YCF4 46
2.2.4 LOESLICHKEIT DES YCF4-PROTEINS 48
2.2.5 KO-IMMUNOPRAEZIPITATIONSEXPERIMENTE 49
2.3 HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON APSWV-PFLANZEN 52
2.3.1 GEZIELTE INAKTIVIERUNG VON PSBN IM PIASTIDENGENOM VON NICOTIANA
TABACUM.. 52
2.3.2 PHAENOTYP DER APSWV-PFLANZEN 57
2.3.3 TRANSKRIPTAKKUMULATION VON GENEN DES PSBB- OPERONS UND VON P S B N
58
2.3.4 TRANSLATION DER GENE PSBB UND P S B N 61
2.3.5 PHOTOSYNTHETISCHE PARAMETER DER APS^/V-PFLANZEN 63
3 DISKUSSION 66
3.1 DAS PLASTIDENKODIERTE YCF4 IST EIN NICHT-ESSENTIELLES HELFERPROTEIN
IN DER
PSI-ASSEMBLIERUNG HOEHERER PFLANZEN 66
3.1.1 AYC/4-PFLANZEN SIND SPEZIFISCH BEEINTRAECHTIGT IN DER
PSI-AKKUMULATION 66
3.1.2 YCF4 IST NICHT ESSENTIELL FUER PHOTOAUTOTROPHES WACHSTUM 67
3.1.3 YCF4 WIRKT POSTTRANSLATIONAL IN DER PSI-ASSEMBLIERUNG ODER
STABILISIERUNG 68
3.1.4 YCF4-PROTEIN AKKUMULIERT ENTWICKLUNGSABHAENGIG 69
3.1.5 YCF4 KO-MIGRIERT MIT HOCHMOLEKULAREN KOMPLEXEN 70
3.1.6 DER C-TERMINUS VON YCF4 IST ESSENTIELL FUER DIE YCF4-AKKUMULATION
71
3.1.7 YCF4 IST SCHLECHT LOESLICH IN NATIVEN BEDINGUNGEN 72
3.1.8 KO-IMMUNPRAEZIPITATION MIT EPITOP-MARKIERTEN YCF4 73
3.1.9 Y C F 4 - AUSBLICK 75
3.1.10 YCF4 - ZUSAMMENFASSUNG 76
3.2 PSBN - EINE ECHTE PSII-UNTEREINHEIT? 77
3.2.1 INAKTIVIERUNG VON P S B N 78
3.2.2 DIE/WWV-MUTATION BEEINTRAECHTIGT NICHT DIE TRANSKRIPTION DES
PSBB-OPERONS ..79
3.2.3 DIE PSBN-MRNA WIRD IN DEN A/WITV-LINIEN NICHT TRANSLATIERT 79
3.2.4 TRANSLATION VON PSBB IST UNBEEINTRAECHTIGT IN APSOEIV-LINIEN 80
4
IMAGE 3
3.2.5 DIE APSBN- PFTAXA&A. SIND STARK RETARDIERT IM PHOTOAUTOTROPHEN
WACHSTUM 81
3.2.6 PSBN - AUSBLICK 82
3.2.7 PSBN - ZUSAMMENFASSUNG 84
4 MATERIAL UND METHODEN 85
4.1 MATERIAL 85
4.1.1 ORGANISMEN 85
4.1.2 VEKTOREN, OLIGONUKLEOTIDE UND SONDEN 85
4.1.2.1 VEKTOREN 85
4.1.2.2 OLIGONUKLEOTIDE 86
4.1.2.3 SONDEN 87
4.1.3 SPEZIELLE CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 88
4.1.4 ANTIKOERPER UND ENZYME 89
4.1.5 GERAETE 91
4.1.6 MEDIEN ZUR KULTIVIERUNG VON E. COLI UND N. TABACUM 92
4.2 METHODEN 93
4.2.1 ANZUCHTSBEDINGUNGEN VON PFLANZEN UND BAKTERIEN 93
4.2.1.1 ANZUCHT VON PFLANZEN IN STERILKULTUR 93
4.2.1.2 ANZUCHT VON PFLANZEN AUF ERDE 93
4.2.1.3 ANZUCHTSBEDINGUNGEN VON NICOTIANA TABACUM 94
4.2.1.4 ANZUCHT VON ESCHERICHA COLI 94
4.2.2 TRANSFORMATION VON PFLANZEN UND BAKTERIEN 94
4.2.2.1 PIASTIDENTRANSFORMATION VON NICOTIANA TABACUM 94
4.2.2.2 TRANSFORMATION CHEMOKOMPETENTER E. COLI- ZELLEN 94
4.2.3 ISOLATION UND AUFREINIGUNG VON NUKLEINSAEUREN 95
4.2.3.1 PLASMIDPRAEPERATION AUS E.COLI 95
4.2.3.2 PLASMID-MIDIPREPARATION 95
4.2.3.3 ISOLATION GESAMTZELLULAERE DNA (DOYLE ET AL. 1990) 95
5
IMAGE 4
4.2.3.4 AUFREINIGUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN ODER PCR ANSAETZEN 96
4.2.3.5 ISOLATION VON GESAMTZELLULAERE RNA 96
4.2.3.6 ISOLATION VON POLYSOMALER MRNA 96
4.2.4 AUFTRENNUNG VON NUKLEINSAEUREN 98
4.2.4.1 AUFTRENNUNG VON DNA IN AGAROSEGELEN 98
4.2.4.2 AUFTRENNUNG VON RNA IN DENATURIERENDEN AGAROSEGELEN 98
4.2.4.3 SPEKTROPHOTOMETRISCHE QUANTIFIZIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 98
4.2.5 SPALTUNG VON NUKLEINSAEUREN 99
4.2.5.1 SPALTUNG DURCH RESTRIKTIONSENZYME 99
4.2.5.2 SPALTUNG DURCH RNASE A 99
4.2.6 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 99
4.2.7 IMMOBILISIERUNG VON NUKLEINSAEUREN AUF EINER NYLONMEMBRAN 99
4.2.7.1 SOUTHERN-BLOT 99
4.2.7.2 NORTHERN-BLOT 100
4.2.8 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON NUKLEINSAEUREN MIT DER KLENOW-POLYMERASE
100
4.2.9 HYBRIDISIERUNG MIT RADIOAKTIV MARKIERTEN NUKLEINSAEUREN 100
4.2.10 DETEKTION VON RADIOAKTIV MARKIERTEN SONDEN 101
4.2.11 PCR {POLYMERASE CHAIN REACTION) 101
4.2.12 CDNA-SYNTHESE UND QRT-PCR 101
4.2.13 SEQUENZIERUNG 101
4.2.14 ISOLATION VON THYLAKOIDMEMBRANPROTEINEN 101
4.2.15 CHLOROPHYLLBESTIMMUNG 102
4.2.16 AUFTRENNUNG VON PROTEINEN MITTELS POLYACRYLAMID GEL
ELEKTROPHORESE (PAGE) 102
4.2.16.1 DENATURIERENDE POLYACRYLAMID GEL ELEKTROPHORESE NACH LAEMMLI
102
4.2.16.2 DENATURIERENDE POLYACRYLAMID GELELEKTROPHORESE NACH SCHAEGGER
103
4.2.16.3 BN (BLUE NATIVE)-?AGE 104
6
IMAGE 5
4.2.17 VISUALISIERUNG AUFGETRENNTER PROTEINE 106
4.2.17.1 FAERBUNG MIT COLLOIDALEN COOMASSIE 106
4.2.17.2 WESTERN-BLOT UND IMMUNODETEKTION 106
4.2.17.3 ELEKTROBLOTTINGVON BN-GELEN 107
4.2.18 IMMUNOPREZIPITATIONEN 107
4.2.19 TRYPTISCHER IN-GEL-VERDAU 107
4.2.20 GENERATION VON PEPTIDANTIKOERPERN 109
4.2.20.1 ANTIKOERPER GEGEN YCF4 109
4.2.20.2 ANTIKOERPER GEGEN PSBN 109
4.2.21 AUFREINIGUNG EINES POLYKLONALEN ANTIKOERPERS 109
4.2.22 BESTIMMUNG VON PHOTOSYNTHESE-PARAMETEN 110
5 ANHANG 111
6 LITERATUR 119
7 EIDESSTAATLICHE ERKLAERUNG 129
8 DANKSAGUNG 130
7
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