Regulatorische Aspekte der Expression und Sekretion heterologer Proteine in Corynebacterium glutamicum:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Jülich
Forschungszentrum Jülich, Zentralbibliothek
2013
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| Schriftenreihe: | Schriften des Forschungszentrums Jülich
Reihe Gesundheit ; 62 |
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INHALTSVERZEICHNIS
I. ZUSAMMENFASSUNG 1
II. SUMMARY 3
III. EINLEITUNG 5
1 BIOTECHNOLOGISCHE HERSTELLUNG REKOMBINANTER PROTEINE 5
1.1 DIE SEKRETORISCHE PRODUKTION REKOMBINANTER PROTEINE 6
2 CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM ALS WIRTSORGANISMUS ZUR HERSTELLUNG
REKOMBINANTER PROTEINE 9
3 STRESSANTWORTEN IN MIKROORGANISMEN AUFGRUND VON PROTEINEXPRESSION
UND -SEKRETION 12
3.1 DIE UEBEREXPRESSION VON PROTEINEN KANN ZUR INDUKTION DER
HITZESCHOCKANTWORT FUEHREN 13
3.2 SCHUTZ DURCH DIE EXTRACYTOPLASMATISCHE PROTEASE HTRA 14
3.3 SCHUTZ DER ZELLHUELLE DURCH DEN SIGMAFAKTOR A E 15
3.4 SCHUTZ DER ZELLHUELLE DURCH DAS ZWEIKOMPONENTENSYSTEM CPXAR 16
3.5 SCHUTZ DER ZELLHUELLE DURCH DAS ZWEIKOMPONENTENSYSTEM CSSRS 17
3.6 SCHUTZ DER ZELLHUELLE DURCH DAS ZWEIKOMPONENTENSYSTEM BAESR 18
3.7 SCHUTZ DER ZELLHUELLE DURCH DAS PHAGE SHOCK PROTEIN (PSP)-SYSTEM 18
3.8 SCHUTZ DER ZELLHUELLE DURCH DAS ZWEIKOMPONENTENSYSTEM LIASR 19
4 DIE BIOTECHNOLOGISCHE NUTZUNG VON ZELLHUELLENSCHUTZSYSTEMEN 20
4.1 DIE NUTZUNG DES WISSENS UEBER DAS PSP-SYSTEM 20
4.2 DIE NUTZUNG DES WISSENS UEBER DAS CSSRS-SYSTEM 20
5 GENOMWEITE TRANSKRIPTIONSANALYSEN ZUR DEFINITION VON
ZELLHUELLENSTRESSANTWORTEN ALS REAKTION AUF DIE UEBEREXPRESSION UND
SEKRETION VON PROTEINEN 21
6 MOEGLICHE ENGPAESSE BEI DER EXPRESSION UND SEKRETION HETEROLOGER
PROTEINE IN
C. GLUTAMICUM 22
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IMAGE 2
II
7 ZIEL DER ARBEIT 23
IV. MATERIAL UND METHODEN 25
1 CHEMIKALIEN UND ENZYME 25
2 BAKTERIENSTAEMME, PLASMIDE UND OLIGONUKLEOTIDE 25
2.1 BAKTERIENSTAEMME 25
2.2 PLASMIDE 26
2.3 OLIGONUKLEOTIDE 27
3 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 30
3.1 NAEHRMEDIEN 30
3.2 KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN UND STAMMHALTUNG 31
4 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 34
4.1 DNA-ISOLIERUNG 34
4.2 DNA- / RNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 34
4.3 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 34
4.4 AUFREINIGUNG VON DNA 35
4.5 AMPLIFIKATION VON DNA PER PCR (POLYMERASEKETTENREAKTION) 35
4.6 RESTRIKTION VON DNA 36
4.7 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA 36
4.8 LIGATION VON DNA 36
4.9 KLONIERUNGEN 36
4.10 HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN UND TRANSFORMATION 38
4.11 SEQUENZIERUNG VON DNA 40
4.12 KONSTRUKTION VON DELETIONSMUTANTEN IN C. GLUTAMICUM (SCHAEFER ET
AL.,
1994), MODIFIZIERT 40
5 GENOMWEITE TRANSKRIPTIONSANALYSEN MIT HILFE VON DNA-MICROARRAYS 41
5.1 ISOLIERUNG VON RNA 41
IMAGE 3
5.2 ANALYSE DER ISOLIERTEN RNA MIT HILFE VON DENATURIERENDEM
FORMALDEHYD-
AGAROSEGEL 41
5.3 SYNTHESE FLUORESZENZMARKIERTER CDNA 42
5.4 HYBRIDISIERUNG DER FLUORESZENZMARKIERTEN CDNA AUF DNA-MICROARRAYS
... 43
5.5 AUSLESEN DER DNA-MICROARRAYS 44
5.6 AUSWERTUNG DER DNA-MICROARRAY-DATEN 44
6 BIOCHEMISCHE METHODEN 44
6.1 ANALYSE VON PROTEINEXPRESSION UND -SEKRETION IN C. GLUTAMICUM 44
6.2 WESTERN BLOT (TOWBIN ET AL., 1979), MODIFIZIERT 46
6.3 HERSTELLUNG VON LOESLICHEM ROHEXTRAKT MIT E. COLI 47
6.4 AUFREINIGUNG VON PROTEINEN MIT HEXAHISTIDINTAG MIT HILFE VON
NICKEL-NTAAGAROSE 48
6.5 UMPUFFERUNG VON GEREINIGTEM PROTEIN PER PD-10 SAEULE 49
6.6 THROMBIN-VERDAU 49
6.7 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN 49
6.8 GELRETARDATIONSEXPERIMENTE 49
6.9 NATIVE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 50
7 BIOINFORMATISCHE METHODEN 50
7.1 DIE DNA-MOTIVSUCHE MIT MEME (BAILEY & ELKAN, 1994) 50
V. ERGEBNISSE 51
1 UNTERSUCHUNG DES TRANSKRIPTOMS VON C. GLUTAMICUM BEI EXPRESSION UND
TAT
ABHAENGIGER SEKRETION HETEROLOGER PROTEINE 51
1.1 GFP ALS MODELLPROTEIN 53
1.2 MALE ALS MODELLPROTEIN 76
1.3 C. GLUTAMICUM ATCC 13032 ATATAC ALS SIMULATION EINER AUSGELASTETEN
TAT-TRANSLOKASE 77
1.4 FAZIT DER UNTERSUCHUNG DER TRANSKRIPTIONELLEN REAKTIONEN AUF DIE
TAT
ABHAENGIGE TRANSLOKATION VON PROTEINEN IN C. GLUTAMICUM 85
IMAGE 4
IV
2 UNTERSUCHUNG AUSGEWAEHLTER REAKTIONEN VON C. GLUTAMICUM AUF DIE
EXPRESSION
UND SEE-ABHAENGIGE SEKRETION HETEROLOGER PROTEINE 86
2.1 HTRA (CG0998 ) LIEGT IN C. GLUTAMICUM IN DER GLEICHEN ANORDNUNG WIE
IN
M. TUBERCULOSIS HINTER EINEM ZWEIKOMPONENTENSYSTEM 87
2.2 TRANSKRIPTIONELLE REGULATION VON GENEN, DIE FUER PROTEINE MIT
PSPC( PHAGE SHOCK PROTEIN C) ODER PSPA-DOMAENE KODIEREN, ALS REAKTION
AUF DIE
EXPRESSION UND SEE-ABHAENGIGE SEKRETION EINES HETEROLOGEN PROTEINS IN
C. GLUTAMICUM 101
VI. DISKUSSION 125
1.1 DIE EXPRESSION DES SIGNALPEPTIDLOSEN GFP INDUZIERT DIE SOS-ANTWORT.
125
1.2 DIE EXPRESSION SOWIE DIE SEKRETION VON CG0955-GFP FUEHRT ZUR
REPRESSION
VON GENEN, DIE IN DIE KUPFERHOMOEOSTASE INVOLVIERT SIND - UND TEILWEISE
TAT
ABHAENGIG TRANSLOZIERT WERDEN 127
1.3 DIE EXPRESSION UND SEKRETION VON PHOD BS -GFP FUEHRT ZUR INDUKTION
VON
GENEN FUER CHAPERONE IN C. GLUTAMICUM 129
1.4 AUCH NACH LAENGERER EXPRESSION UND SEKRETION VON PHOD BS -GFP
ERFOLGEN
KEINE SPEZIFISCHEN REAKTIONEN AUF DIE SEKRETION DES HETEROLOGEN
PROTEINS.... 131
1.5 C. GLUTAMICUM ZEIGT AUF DIE EXPRESSION UND TAT-ABHAENGIGE SEKRETION
DES
MODELLPROTEINS TORA-MALE KEINE REAKTIONEN AUF TRANSKRIPTIONELLER EBENE
132
1.6 C. GLUTAMICUM ATCC 13032 ATATAC ALS SIMULATION VOLLSTAENDIGER
AUSLASTUNG DER TAT-TRANSLOKASE ZEIGT TRANSKRIPTIONEILE REAKTIONEN 133
1.7 FAZIT ZUR EXPRESSION UND TAT-ABHAENGIGEN SEKRETION VON HETEROLOGEN
PROTEINEN IN C. GLUTAMICUM 137
2 HINWEISE AUF EINE BETEILIGUNG DER ZWEIKOMPONENTENSYSTEME CGTRS2 UND
CGTSR7 AM SCHUTZ DER ZELLHUELLE 139
2.1 DAS ZWEIKOMPONENTENSYSTEM CGTRS2 139
2.2 DAS ZWEIKOMPONENTENSYSTEM CGTSR7 147
VII. LITERATUR 155
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