Weiterentwicklung pockenviraler Vakzinekandidaten zur Verbesserung der Induktion HIV-spezifischer T-Zell Antworten:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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| Veröffentlicht: |
2011
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INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG 1
A. EINLEITUNG 2
A.1 POCKENVIREN 2
A.1.1 POCKENVIREN ALLGEMEIN 2
A. 1.2 VACCINIAVIREN 2
A. 1.2.1 DAS NEW YORK VACCINIAVIRUS (NYVAC) 6
A.2 STAND DER VAKZINEENTWICKLUNG GEGEN DAS HUMANE IMMUNDEFIZIENZVIRUS
TYP1 (HIV-1) 7
A.3 VEKTORSYSTEME UND VAKZINIERUNGSSTRATEGIEN 10
A.3.1 ALLGEMEIN 10
A.3.2 VIRALE VEKTOREN 11
A.3.3 DNA-VAKZINE 14
A.3.4 HETEROLOGE PRIME/BOOST IMMUNISIERUNGSSTRATEGIEN 16
A.4 ZIELSETZUNG 19
B. MATERIAL UND METHODEN 21
B.1 MATERIAL 21
B.1.1 ZELLEN 21
B.1.1.1 PROKARYOTISCHE ZELLEN 21
B.1.1.2 EUKARYOTISCHE ZELLEN 21
B.1.2 VIRUS 21
B.1.3 DNA 22
B.1.3.1 OLIGONUKLEOTIDE 22
B.1.3.2 VEKTOREN 23
B.1.4 ANTIKOERPER UND PEPTIDE 23
B.1.4.1 PRIMAERANTIKOERPER 23
B.1.4.2 SEKUNDAERANTIKOERPER 24
B.1.4.3 PEPTIDE 24
B.1.5 GROESSEN-UND MOLEKULARGEWICHTSTANDARDS 25
B.1.6 KOMMERZIELLE KITS 25
B.1.7 REAGENZIEN 25
B. 1.7.1 ANZUCHTMEDIEN 25
B. 1.7.2 KULTURMEDIEN UND PUFFER 26
B.1.8 VERBRAUCHSMATERIAL 26
B.1.9 VERSUCHSTIERE 26
B.2 METHODEN 26
B.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITSTECHNIKEN 26
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
B.2.1.1 KLONIERUNG 26
B.2.1.2 DNA-AUFREINIGUNG UND ANALYSE 26
B.2.1.2.1 PLASMID-DNA 26
B.2.1.2.2 GENOMISCHE DNA 27
B.2.1.3 PCR-ANALYSE 27
B.2.1.4 HERSTELLUNG REKOMBINANTER NYVACS 27
B.2.1.4.1 HERSTELLUNG DER TRANSFERKONSTRUKTE ZUR INTEGRATION EINES
TRANSGENS IN DEN POCKENVIRALEN VEKTOR NYVAC 27
B.2.1.4.2 EINBRINGEN DES TRANSGENS IN DEN POCKENVIRALEN VEKTOR (1.
HOMOLOGE REKOMBINATION) 29
B.2.1.4.3 ENTFERNEN DES REPORTERGENS LACZ AUS DEM POCKENVIRALEN VEKTOR
(2. HOMOLOGE REKOMBINATION) 30
B.2.2 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 30
B.2.2.1 TRICHLORESSIGSAEURE (TCA)-ACETON FAELLUNG 30
B.2.2.2 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 30
B.2.2.3 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 30 B.2.2.4
WESTERN-BLOT ANALYSE 31
B.2.3 ZELLBIOLOGIE 31
B.2.3.1 ALLGEMEINE ZELLKULTURTECHNIKEN 31
B.2.3.2 TRANSIENTE TRANSFEKTION EUKARYOTISCHER ZELLEN 32
B.2.3.3 ERNTE VON ZELLEN UND UEBERSTAENDEN FUER ANALYTISCHE ZWECKE 32
B.2.3.4 FACS-ANALYSE 32
B.2.3.5 ARBEITSTECHNIKEN MIT VIREN 33
B.2.3.5.1 EINBRINGEN DERTRANSGENE MITTELS IN-VITRO REKOMBINATION (IVR)
33 B.2.3.5.2 AUFREINIGUNG DER UNTERSCHIEDLICHEN NYVAC-VARIANTEN UNTER
VERWENDUNG EINES PLAQUE ASSAYS 33
B.2.3.5.2.1 DURCHFUEHRUNG DES ERSTEN AUFREINIGUNGSSCHRITTS 33
B.2.3.5.2.2 DURCHFUEHRUNG DER WEITEREN AUFREINIGUNGSSCHRITTE 34 B.2.3.5.3
INFEKTION EUKARYOTISCHER ZELLE FUER ANALYTISCHE ZWECKE 34 B.2.3.5.4
HERSTELLUNG HOCHTITRIGER VIRUSSTOCKS 35
B.2.3.5.5 BESTIMMUNG VON VIRUSTITEM MITTELS PLAQUE ASSAY UND
KRISTALLVIOLETTFAERBUNG....36 B.2.3.5.6 PLAQUE ASSAY ZUM NACHWEIS DER
REINHEIT DER HERGESTELLTEN REKOMBINANTEN VIREN 36
B.2.4 IMMUNOLOGISCHE ARBEITSTECHNIKEN 37
B.2.4.1 HALTUNG UND IMMUNISIERUNG VON VERSUCHSTIEREN 37
B.2.4.2 AUSLESEN ZELLULAERER IMMUNANTWORTEN 37
B.2.4.2.1 GENERIERUNG VON PRIMAEREN MAUSSPLENOZYTEN 37
B.2.4.2.2 INTRAZELLULAERE IFNY FAERBUNG UND ANSCHLIESSENDE FACS-ANALYSE 37
C ERGEBNISSE 39
C.1 BESCHREIBUNG DER VERWENDETEN DNA-KONSTRUKTE 39
C.2 ENTWICKLUNG UND VERIFIZIERUNG NEUER DNA-KONSTRUKTE 41
C.2.1 HERSTELLUNG NEUER TRANSGENVARIANTEN DURCH EINFUEGEN NEUER
MODIFIKATIONEN 41 C.2.1.1 ALLGEMEIN 41
C.2.1.2 ENTWICKLUNG EINES GAG UND ENV KODIERENDEN PLASMIDS UNTER
VERWENDUNG EINES 2A-PEPTIDS DES THOSEA ASIGNA VIRUS (TAV) 41
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
C.2.1.3 EINBRINGEN DER IM MURINEN SYSTEM IMMUNDOMINANTEN EPITOPE AUS GAG
UND ENV IN DAS JEWEILS ANDERE TRANSGEN SOWIE DIE DELETION DES
IMMUNDOMINANTEN EPITOPS V11V IM ENV 42
C.2.1 .4 MODIFIKATION DES SIGNALPEPTIDS 44
C.2.1.5 UEBERBLICK MODIFIZIERTE IMMUNOGENE 45
C.2.2 VERIFIZIERUNG DER NEUEN DNA-KONSTRUKTE 46
C.2.2.1 UEBERPRUEFUNG DER PROTEINEXPRESSION DURCH DIE MODIFIZIERTEN
TRANSGENE IM WESTERN-BLOT NACH TRANSFEKTION VON HEK293T ZELLEN 46
C.2.2.2 FACS-ANALYSE BESTAETIGT EXPRESSION DER MODIFIZIERTEN TRANSGENE
MGAG-2A-GP120 UND GP120-2A-MGAG 50
C.3 ENTWICKLUNG UND VERIFIZIERUNG REKOMBINANTER VIREN 51
C.3.1 HERSTELLUNG REKOMBINANTER VIREN 51
C.3.1.1 ALLGEMEIN 51
C.3.1.2 AUFBAU DES TRANSFERVEKTORS PLZAWI 52
C.3.1.3 HOMOLOGE REKOMBINATION 52
C.3.1.3.1 EINBRINGEN DES TRANSGENS IN DEN POCKENVIRALEN VEKTOR NYVAC (1.
REKOMBINATIONSSCHRITT) 52
C.3.1.3.2 ENTFERNEN DES ZUR SELEKTION VERWENDETEN GENS LACZ (2.
REKOMBINATIONSSCHRITT) 54
C.3.2 VERIFIZIERUNG DER REKOMBINANTEN VIREN AM BEISPIEL DES
EINGEBRACHTEN TRANSGENS GAG 55
C.3.2.1 WESTERN-BLOT ANALYSE BESTAETIGT ERFOLGREICHE EXPRESSION DES IM
TRANSFERVEKTOR EINGEBRACHTEN TRANSGENS MGAG 55
C.3.2.2 PCR-ANALYSE BESTAETIGT ERFOLGREICHES EINBRINGEN DES TRANSGENS
MGAG UND ENTFERNEN DES REPORTERGENS LACZ IM POCKENVIRALEN VEKTOR 55
C.3.2.3 WESTERN-BLOT ANALYSE BESTAETIGT EXPRESSION DES EINGEBRACHTEN
TRANSGENS MGAG IN DEN EINZELNEN AUFREINIGUNGSSCHRITTEN 57
C.3.2.4 PLAQUE ASSAY UND ANSCHLIESSENDE WESTERN-BLOT ANALYSE ZEIGEN DIE
EXPRESSION DES TRANSGENS IN 100 % DER REKOMBINANTEN NYVAC- MGAG ....59
C.3.2.5 MIT REKOMBINANTEN NYVACS INFIZIERTE ZELLEN ZEIGEN EXPRESSION DER
EINGEBRACHTEN TRANSGENE 60
C.3.3 UEBERBLICK REKOMBINANTE VIREN 62
C.4 IN VIVO APPLIKATION DER DNA-KONSTRUKTE MIT MODIFIZIERTEN TRANSGENEN
63
C.4.1 UNTERDRUECKUNG GAG-SPEZIFISCHER ZELLULAERER IMMUNANTWORTEN NACH
VERABREICHUNG DER 2A-KONSTRUKTE SOWIE EINER MISCHUNG AUS MGAG UND GP120
63
C.4.2 DELETION DES IMMUNDOMINANTEN ENV-SPEZIFISCHEN EPITOPS V11V IM
GP120 FUEHRT ZUM ERHALT GAG-SPEZIFISCHER T-ZELL ANTWORTEN 65
C.4.3 VERBESSERUNG DER GAG-SPEZIFISCHEN T-ZELL ANTWORTEN DURCH DAS
ENTFERNEN DES ARTIFIZIELLEN SIGNALPEPTIDS AM GP120 67
C.5 IN VIVO APPLIKATION REKOMBINANTER VIREN 69
C.5.1 STEIGERUNG DER GAG- UND POL-SPEZIFISCHEN ZELLULAEREN IMMUNANTWORTEN
DURCH DAS WIEDERHERSTELLEN DES RIBOSOMALEN FRAME-SHIFT SIGNALS 69
C.5.2 DURCH EINE HOMOLOGE PRIME/BOOST APPLIKATION KONNTEN DIE TRANSGEN-
SPEZIFISCHEN ZELLULAEREN IMMUNANTWORTEN NICHT VERSTAERKT WERDEN 71
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
C.5.3 CO-VERABREICHUNG VON GP120 FUEHRT NICHT ZUR UNTERDRUECKUNG GAG- UND
POL- SPEZIFISCHER ZELLULAERER IMMUNANTWORTEN 73
C.5.4 EINE KOMBINIERTE VERABREICHUNG VON VERBESSERTEN PLASMID-DNA-
KONSTRUKTEN UND REKOMBINANTEN NYVACS VERSTAERKT DIE TRANSGEN-SPEZIFISCHE
ZELLULAERE IMMUNANTWORTEN 75
D. DISKUSSION 78
D.1 ENTWICKLUNG UND BEWERTUNG NEUER DNA-KONSTRUKTE 78
D. 1.1 DIE OPTIMIERUNG DER TRANSGENEXPRESSION VERBESSERTE DIE INDUKTION
GAG SPEZIFISCHER ZELLULAERER IMMUNANTWORTEN 78
D.1.2 DER NEGATIVE EINFLUSS DES HIV-1 HUELLPROTEINS ENV AUF DIE
EXPRESSION UND PRAESENTATION CO-VERABREICHTER ANTIGENE KONNTE BESTAETIGT
WERDEN 78
D. 1.3 TRANSGENVARIANTEN ZUR ANALYSE DER ENV/GAG-KOMPETITION ZEIGTEN IN
BIOCHEMISCHEN ANALYSEN DIE ERWARTETEN PROTEINEXPRESSIONEN 80
D.1.4 DIE VERABREICHUNG DER 2A-KONSTRUKTE ZEIGTE IN VITRO EINE
GEMEINSAME EXPRESSION DER PROTEINE IN EINER ZELLE UND FUEHRTE IN VIVO ZUR
UNTERDRUECKUNG GAG-SPEZIFISCHER T-ZELL ANTWORTEN 81
D. 1.5 DIE INDUKTION GAG-SPEZIFISCHER IMMUNANTWORTEN NACH GABE EINER
MISCHUNG AUS MGAG UND GP120AV11V DEUTET AUF EINE KOMPETITION UM DIE
PRAESENTATION AUF MHC-I MOLEKUELEN HIN 83
D.1.6 DIE DELETION DES ARTIFIZIELLEN SIGNALPEPTIDS VON ENV VERBESSERTE
IN GLEICHER WEISE DIE GAG-SPEZIFISCHEN IMMUNANTWORTEN WIE EINE
VERRINGERUNG DER VERABREICHTEN MENGE AN ENV 84
D.2 HERSTELLUNG UND BEWERTUNG REKOMBINANTER NYVAC 86
D.2.1 UNTER VERWENDUNG DER HOMOLOGEN REKOMBINATION WURDEN NEUE NYVAC-
VARIANTEN HERGESTELLT 86
D.2.2 DIE VERIFIZIERUNG DER REKOMBINANTEN NYVACS BESTAETIGTE EINE
EXPRESSION DER TRANSGENE UND EINE HOHE EXPRESSIONSEFFIZIENZ IN ALLEN
REKOMBINANTEN VIREN ..86
D.2.3 VERIFIZIERUNG NEUER REKOMBINANTER NYVACS HINSICHTLICH IHRER
FAEHIGKEIT ZUR INDUKTION SPEZIFISCHER ZELLULAERER IMMUNANTWORTEN 88
D.2.4 DAS EINFUEGEN DES RIBOSOMALEN FRAME-SHIFT SIGNALS BEWIRKTE NACH
APPLIKATION DES NYVAC-^G^PN BEI DER ANALYSE ALLER NYVAC-VARIANTEN EINE
VERBESSERUNG GAG-SPEZIFISCHER T-ZELL ANTWORTEN 89
D.2.5 DIE FAEHIGKEIT ZUR BILDUNG VIRUS-AEHNLICHER PARTIKEL SOWIE DIE
TRENNUNG DER TRANSGENE AUF UNTERSCHIEDLICHE NYVACS FUEHRTE ZU KEINER
WEITEREN VERBESSERUNG DER ZELLULAEREN IMMUNANTWORTEN 89
D.2.6 IM KONTEXT DES VIRALEN VEKTORS NYVAC ZEIGTE SICH KEIN EINFLUSS DER
COVERABREICHUNG VON GP120 AUF DIE INDUKTION GAG-SPEZIFISCHER T-ZELL
ANTWORTEN 91
D.2.7 EINE HOMOLOGE PRIME/BOOSF-STRATEGIE KONNTE DIE INDUKTION
EFFIZIENTER ANTIGEN-SPEZIFISCHER T-ZELL ANTWORTEN NICHT ZUSAETZLICH
VERBESSERN 92
D.2.8 DIE VERBESSERUNG DER DNA-KONSTRUKTE SOWIE DER REKOMBINANTEN VIREN
FUEHRTE IN EINER HETEROLOGEN PRIME/BOOSF-VERABREICHUNG ZU EINER DEUTLICH
GESTEIGERTEN INDUKTION TRANSGEN-SPEZIFISCHER IMMUNANTWORTEN 93
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS
D.3 AUSBLICK 95
D.3.1 DURCHFUEHRUNG WEITERER HETEROLOGER PRIME/BOOSF-STUDIEN 95
D.3.2 ENTWICKLUNG EINES TRANSGEN-GEKOPPELTEN SELEKTIONSSYSTEMS ZUR
PRODUKTION REKOMBINANTER VACCINIAVIREN 96
D.3.3 WEITERENTWICKLUNG EINER SCHNELLEREN HERSTELLUNG REKOMBINANTER
NYVACS DURCH DIE VENWENDUNG EINER BAC-TECHNOLOGIE 97
E. ANHANG 98
E.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 98
E.2 ERGAENZENDE ABBILDUNGEN 99
E.2.1. VERIFIZIERUNG NYVACJ^GPN 99
E.2.2. VERIFIZIERUNG NYVAC_ AMGFSPN 100
E.2.3. VERIFIZIERUNG NYVAC_ MGFSPN 101
E.2.4. VERIFIZIERUNG NYVACJ^GAG 102
E.2.5. VERIFIZIERUNG NYVAC_PN 103
E.2.6. VERIFIZIERUNG NYVAC_GP120 104
E.3 DNA-KONSTRUKTE 105
E.4 LITERATURVERZEICHNIS 109
DANKSAGUNG 123
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