Selektive Hemmstoffe von Methionin-Aminopeptidasen (MetAPs) verschiedener Organismen:
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2010
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INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG 9
2 SUMMARY 11
3 EINLEITUNG 13
3.1 THERAPEUTISCHE BEDEUTUNG DER METAPS 13
3.2 FUNKTION UND STRUKTUR VON METAPS 17
3.3 SPALTHEFE ( SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE) - KULTURGESCHICHTLICHE
BEDEUTUNG UND MODERNER BIOTECHNOLOGISCHER EINSATZ 19
3.4 UEBERSICHT DER METAP-ASSAYS 21
3.5 BEKANNTE METAP INHIBITOREN 24
3.6 BEURTEILUNG DER BEKANNTEN METAP INHIBITOREN 34
4 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 35
5 ERGEBNISSE 36
5.1 AUFBAU DER METAP-ENZYMBIBLIOTHEK 36
5.1.1 EXPRESSION VON E. COLI METAP IN E. COLI 36
5.1.2 EXPRESSION VON S. AUREUS METAP IN E. COLI 37
5.1.2.1 HINTERGRUND 37
5.1.2.2 KLONIERUNG 37
5.1.2.3 PROTEINEXPRESSION UND ISOLIERUNG 40
5.1.2.4 ASSAYBEDINGUNGEN DER S. AUREUS METAP 41
5.1.3 EXPRESSION DER HSMETAP-L IN E. COLI. 43
5.1.3.1 KLONIERUNG 43
5.1.3.2 PROTEINEXPRESSION UND ISOLIERUNG 45
5.1.3.3 IN VITRO ASSAY DER HSMETAP-L 48
5.1.4 EXPRESSION DER HUMANEN METAP-L (A1-79) 50
5.1.4.1 HINTERGRUND 50
5.1.4.2 KLONIERUNG 50
5.1.4.3 PROTEINEXPRESSION 53
5.1.4.4 IN VITRO ASSAY DER HSMETAP-L (A1 -79) 54
5.1.5 HUMANE METAP-L (A1-109) 55
5.1.5.1 KLONIERUNG 55
5.1.5.2 PROTEINEXPRESSION 57
5.1.6 EXPRESSION HUMANER METAP-LL IN E. COLI 58
5.1.6.1 KLONIERUNG 58
5.1.6.2 PROTEINEXPRESSION 60
5.1.7 EXPRESSION HUMANER METAP-LL IN S. POMBE 60
5.1.8 EXPRESSION HUMANER METAP-LL IN SF9-ZELLEN 64
5.1.8.1 PROTEINGEWINNUNG 64
5.1.8.2 ASSAYBEDINGUNGEN DER HUMANEN METAP-LL 65
5.1.9 AKTIVITAETSBESTIMMUNG DER EXPRIMIERTEN METAPS 67
5.1.10 ZUSAMMENFASSUNG DER METAP-BIBLIOTHEK 68
7
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IMAGE 2
5.2 MANNICHBASEN - NEUE HEMMSTOFFE DER METAP 69
5.2.1 LEITSTRUKTUR 69
5.2.2 UNTERSUCHUNG DER METALLKOMPLEXBILDUNG 71
5.2.3 ZEITABHAENGIGKEIT DER INHIBITION 73
5.2.4 STRUKTUR-WIRKUNGSBEZIEHUNGEN DER MANNICHBASEN 74
5.2.5 KRISTALLSTRUKTUR UND WIRKMECHANISMUS 77
5.2.6 INHIBITION DER TRUNKIERTEN HUMANEN METAP-L 85
5.2.7 ANTIBAKTERIELLE WIRKUNG DER MANNICHBASEN 87
5.2.8 CYTOTOXISCHE WIRKUNG DER MANNICHBASEN 89
5.3 PHENOLISCHE NATURSTOFFE 91
5.4 BENZIMIDAZOLDERIVATE (N,N CHELATBILDNER) 94
6 DISKUSSION 99
6.1 BEDEUTUNG DER METAP BIBLIOTHEK 99
6.2 MANNICHBASEN - WIRKMECHANISMUS UND DIE MOEGLICHE THERAPEUTISCHE
KONZEPTION 103
6.3 AUSBLICK 110
7 MATERIALIEN UND METHODEN 111
7.1 DNA KLONIERUNG IN E. COLI 111
7.1.1 EINLEITUNG 111
7.1.2 ARBEITSPROTOKOLL ZU KLONIERUNGSMETHODE A 115
7.1.3 ARBEITSPROTOKOLL ZU KLONIERUNGSMETHODE B 117
7.2 GEWINNUNG ELEKTROKOMPETENTER E. COLI ZELLEN 122
7.3 NAEHRMEDIEN FUER E. COLI UND S. POMBE 123
7.4 BAKTERIENTRANSFORMATION MITTELS ELEKTROPORATION 125
7.5 ISOLIERUNG UND AUFARBEITUNG VON REKOMBINANTEN PROTEINEN AUS
BAKTERIEN ZELLEN 125
7.6 EXPRESSION VON HSMETAP-LL IN S. POMBE 128
7.7 EXPRESSION DER HSMETAP-LL IN SF9-ZELLEN 132
7.8 SDS-PAGE UND IMMUNOBLOTTING 135
7.9 IN VITRO METAP-ASSAY 137
7.10 BESTIMMUNG DER ANTIBAKTERIELLEN AKTIVITAET 142
7.11 COKRISTALLISATION VON MA-01 MIT E. COLI METAP 142
7.12 SYNTHESE DER MANNICHBASEN 144
8 ANHANG 151
8.1 PRIMERSEQUENZEN UND IHRE BEDEUTUNG 151
8.2 ALIGNMENT DER EXPRIMIERTEN METAPS 153
8.3 TESTERGEBNISSE DER AUSGANGSVERBINDUNGEN DER MANNICHBASEN 155 8.4
CHEMIKALIENUEBERSICHT 157
8.5 GERAETEUEBERSICHT 160
8.6 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 161
8.7 REFERENZEN 162
8
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