Funktion der Kanalproteine TRPC1 und TRPC6 in embryonalen Fibroblasten und Podozyten der Maus:
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INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG 1
2 SUMMARY 3
3 EINLEITUNG 5
3.1 FUNKTION VON CALCIUM IN DER ZELLE 5
3.2 FUNKTION DER PHOSPHOLIPASEN C 6
3.3 ENTDECKUNG DER T R P S 8
3.4 DIE TRP-FAMILIE 9
3.5 DIE TRPC-UNTERFAMILIE 13
3.6 NIEREN- UND PODOZYTENFUNKTION 18
3.7 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 22
4 MATERIAL UND METHODEN 24
4.1 MATERIAL 24
4.1.1 CHEMIKALIEN 24
4.1.2 ENZYME, KITS, MARKER 26
4.1.3 GERAETE 27
4.1.4 VERBRAUCHSMATERIAL 28
4.1.5 STANDARDLOESUNGEN UND PUFFER 28
4.1.5.1 PBS (PHOSPHATE BUFFERED SALINE) 28
4.1.5.2 P B S T 28
4.1.5.3 4-FACH TRIS/SDS PUFFER PH 6,8 28
4.1.5.4 4-FACH TRIS/SDS PUFFER PH 8,8 29
4.1.5.5 2-FACH LAEMMLI (LADEPUFFER FUER PROTEINELEKTROPHORESE) . . 29
4.1.5.6 10-FACH LAUFPUFFER (FUER DIE SDS-PAGE GELELEKTROPHORESE) . 29
4.1.5.7 10-FACH TRANSFERPUFFER (FUER DEN TRANSFER VON PROTEINEN
AUF NITROZELLULOSEMEMBRAN) 30
4.1.5.8 LYSEPUFFER 30
4.1.5.9 SOB-MEDIUM 30
II
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.5.10 SOC-MEDIUM 31
4.1.5.11 STOPPLOESUNG 31
4.1.5.12 FIXIERER 31
4.1.5.13 TRANSFORMATIONSPUFFER (FUER DIE HERSTELLUNG KOMPETENTER
BAKTERIEN) 31
4.1.5.14 DAPI-GEBRAUCHSLOESUNG 31
4.1.5.15 2-FACH HEPES-RINGER LOESUNG 32
4.1.5.16 LB-MEDIUM 32
4.1.5.17 50-FACH TRIS-ACETAT-EDTA-PUFFER (TAE-PUFFER) 32
4.1.5.18 PUFFER B (VERDAU VON MAUSGEWEBE) 32
4.1.5.19 ISOLIERLOESUNG 33
4.1.5.20 HBSS-PUFFER (HBSS = HANK S BALANCED SALT SOLUTION) . . 33
4.1.5.21 DEPC-WASSER 33
4.1.6 ANTIKOERPER 34
4.1.6.1 ERSTANTIKOERPER 34
4.1.6.2 ZWEITANTIKOERPER 35
4.1.6.3 TOXINE 35
4.1.7 PLASMIDE 35
4.1.8 OLIGONUKLEOTIDE 36
4.1.8.1 GENOTYPISIERUNG VON MAEUSEN 36
4.1.8.2 OLIGONUKLEOTIDE FUER QUANTITATIVE REVERSE TRANSCRIPTASE(RT)P C R
37
4.1.8.3 OLIGONUKLEOTIDE FUER DIE MUTAGENESE 37
4.1.8.4 OLIGONUKLEOTIDE FUER DIE KLONIERUNG 38
4.1.9 SONSTIGE HILFSMITTEL 39
4.2 MAEUSE 39
4.2.1 TIERHALTUNG 39
4.2.2 MAUSLINIEN 40
4.2.3 GENOTYPISIERUNG DER MAEUSE 40
4.2.4 PRAEPARATION VON ORGANEN 41
4.3 ZELLKULTUR 42
4.3.1 ISOLATION 42
4.3.1.1 ISOLATION VON EMBRYONALEN FIBROBLASTEN 42
4.3.1.2 ISOLATION VON PODOZYTEN 42
4.3.2 KULTIVIERUNG DER ZELLEN 43
4.3.3 ZELLLINIEN UND NAEHRMEDIEN 43
III
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.4 TVANSFEKTIONEN 44
4.3.5 KRYOKONSERVIERUNG VON KULTIVIERTEN ZELLEN J . . 45
4.4 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 46
4.4.1 HERSTELLUNG VON PROTEINLYSATEN 46
4.4.2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN 46
4.4.3 OBERFLAECHENBIOTINYLIERUNG 47
4.4.4 KOIMMUNPRAEZIPITATION 49
4.4.5 SDS-PAGE (SODIUM DODECYLSULFATE POLYACRYLAMIDE GEL
ELECTROPHORESIS) 50
4.4.6 ELEKTROTRANSFER VON PROTEINEN AUF EINE MEMBRAN 51
4.4.7 WESTERN BLOT 52
4.5 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 53
4.5.1 RNA ISOLIERUNG AUS ZELLEN 53
4.5.2 ERSTSTRANGSYNTHESE * 53
4.5.3 QUANTITATIVE RT(REVERSE-TRANSCRIPTASE)-PCR 54
4.5.4 LIGATION 55
4.5.5 MUTAGENESE 56
4.5.6 HERSTELLUNG VON AGARPLATTEN 57
4.5.7 HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIEN 57
4.5.8 TRANSFORMATION VON PLASMID-DNA IN KOMPETENTE BAKTERIEN . . . . 58
4.5.9 ISOLATION VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN 58
4.5.10 KONZENTRATIONS- UND REINHEITSBESTIMMUNG VON DNA 59
4.5.11 SEQUENZIERUNG 59
4.5.12 DNA-VERDAU MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 59
4.5.13 DNA-AUFTRENNUNG MITTELS ELEKTROPHORESE 60
4.6 SPEZIELLE MESSMETHODEN UND VERSUCHE 60
4.6.1 MIKROSKOPISCHE ANALYSE DER ZELLMIGRATION 60
4.6.2 WUNDHEILUNG-TEST MIT HILFE DES ELECTRICAL CELL IMPEDANCE SENSOR
SYSTEMS 61
4.6.3 MESSUNG DER INTRAZELLULAEREN C A 2 + - IONEN KONZENTRATION MITTELS
CALCIUM IMAGING 61
4.6.3.1 VORBEREITUNGEN 62
4.6.3.2 BELADEN DER ZELLEN 63
4.6.3.3 MESSEN DER ZELLEN 64
4.6.4 IMMUNHISTOLOGISCHE ZELLFAERBUNG DER PODOZYTEN 64
4.6.5 PHALLOIDIN-FAERBUNG 65
IV
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
4.6.6 APOPTOSE-UNTERSUCHUNGEN 66
4.6.6.1 QUANTIFIZIERUNG VON APOPTOSERATEN MIT HILFE DES TUNELASSAYS 66
4.6.6.2 APOPTOSE-UNTERSUCHUNG DURCH ANNEXIN-FAERBUNG 67
4.6.6.3 BESTIMMUNG DER APOPTOSEEIGENSCHAFTEN VON ZELLEN MIT
CASPASEGLOW 68
4.6.7 MESSUNG DER ZELLVIABILITAET MIT DEM W S T (WATER SOLUBLE
TETRAZOLIUM)ASSAY 68
4.6.8 INHIBITION DER RHO-PROTEINE MIT SPEZIFISCHEN TOXINEN 69
4.6.9 INHIBITION DER G I2/I3-PROTEINE MIT HILFE VON SPEZIFISCHEN SHRNAS
69
4.6.10 KLONIERUNG DES M T R P C L 69
4.6.11 FUSION DER M T R P C L MRNA MIT DER CODIERENDEN REGION EINES
HAEMAGGLUTININ-EPITOPS 71
4.7 STATISTIK 73
ERGEBNISSE 74
5.1 ANALYSE DER TRPCL-PROZESSIERUNG UND -FUNKTION 74
5.1.1 HETEROLOGE EXPRESSION EINES MURINEN TRPCL-KANALS 74
5.1.1.1 KLONIERUNG EINER MURINEN TRPC1 CDNA 74
5.1.1.2 HETEROLOGE EXPRESSION DES MURINEN TRPCL-KANALS UND
NACHWEIS DER EXPRESSION IM WESTERN BLOT 76
5.1.1.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR ENZYMATISCHEN PROZESSIERUNG DES M T R P C L
PROTEINS DURCH APPLIKATION VON PROTEASEINHIBITOREN . . . 77
5.1.1.4 PROTEOLYSE DES TRPCL-KANALS DURCH TRYPSIN 79
5.1.2 TRPC1 IN PRIMAEREN EMBRYONALEN FIBROBLASTEN DER MAUS 80
5.1.2.1 VERGLEICHENDE ANALYSE VON EMBRYONALEN MAUSFIBROBLASTEN
(MEFFE) AUS TRPCL-DEFIZIENTEN- UND WILDTYP-MAEUSEN 80
5.1.2.2 ANALYSE DER MIGRATION UND PROLIFERATION DER EMBRYONALEN
MAUSFIBROBLASTEN (MEFLS) IN EINEM TEST AUF WUNDHEILUNG 80
5.2 TRPC6 -PLCE-INTERAKTION IN PODOZYTEN DER NIERE 82
5.2.1 IMMUNHISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN VON PODOZYTEN 82
5.2.2 ANALYSE DER MRNA-EXPRESSIONSPROFILE IN PODOZYTEN MITTELS QUAN
TITATIVER REAL TIME PCR 82
5.2.3 QUANTIFIZIERUNG DER TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ EINES MARKERPLASMIDS IN
PRIMAEREN PODOZYTEN 83
5.2.4 QUANTIFIZIERUNG DER ZELLVIABILITAET DER PODOZYTEN 85
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS
5.2.5 QUANTIFIZIERUNG VON NEKROTISCHEN UND APOPTOTISCHEN PODOZYTEN . .
86 5.2.6 REGULATION DER CAICIUM-HOMOEOSTASE IN PODOZYTEN NACH REZEPTOR
STIMULATION 90
5.2.7 NACHWEIS EINER DIREKTEN INTERAKTION ZWISCHEN P L C E U N D T R P C
6
DURCH KOIMMUNPRAEZIPITATION IN HEK293-ZELLEN U N D IN PODOZYTEN 92
5.2.8 VERGLEICH DER PLCE-WT M I T EINER PLCC-PATIENTENMUTATION IN
HEK293ZELLEN 93
5.2.9 UNTERSUCHUNGEN ZUR AUFKLAERUNG DER SIGNALTRANSDUKTIONSKASKADE VON
DER BINDUNG VON ANGIOTENSIN II A N DEN ATI-REZEPTOR ZUR AKTIVIE
RUNG DES TRPC6-KANALS 94
5.2.10 ANALYSE DER KONTRAKTILEN FUNKTIONEN DURCH UNTERSUCHUNGEN AM
AKTINZYTOSKELETT DES PODOZYTEN 96
6 DISKUSSION 103
6.1 ANALYSE DER TRPCL-PROZESSIERUNG UND -FUNKTION 103
6.1.1 ANALYSE DER TRPCL-EXPRESSION UND -PROZESSIERUNG 103
6.1.2 ANALYSE DER TRPCL-FUNKTION IM MURINEN EMBRYONALEN FIBROBLA
STEN (MEES) 105
6.2 TRPC6-PLCE-INTERAKTION IN PODOZYTEN DER NIERE 106
6.2.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR TRPC6- UND PLCE-FUNKTION IN PRIMAER ISO
LIERTEN PODOZYTEN UND HEK293-ZELLEN 106
6.3 AUSBLICK 114
7 ANHANG 115
7.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 115
7.2 DANKSAGUNG 119
LITERATURVERZEICHNIS 120
VI
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