Versuche zur Entwicklung eines kompetitiven ELISAs zum Nachweis des pestiviralen Core-Proteins:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Gießen
VVB Laufersweiler Verlag
2012
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
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| Beschreibung: | VII, 88 S. graph. Darst. 210 mm x 146 mm, 169 g |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 KLASSISCHE SCHWEINEPEST 1
1.1.1 EPIDEMIOLOGIE 1
1.1.2 KLINIK : 2
1.1.2.1 AKUTE VERLAUFSFORM 2
1.1.2.2 CHRONISCHE VERLAUFSFORM 3
1.1.2.3 VERLAUFSFORM MIT KSP-PERSISTENZ 3
1.1.3 PATHOGENESE 4
1.1.4 BEKAEMPFUNG 5
1.1.4.1 IMPFUNG GEGEN DIE KLASSISCHE SCHWEINEPEST 6
1.2 PESTIVIREN 8
1.2.1 TAXONOMIE 8 / 1.2.2 ANDERE PESTIVIRALE ERKRANKUNGEN 8
1.2.3 MOLEKULARER AUFBAU 9
1.2.4 DER PESTIVIRALE INFEKTIONSZYKLUS 11
1.3 LABORDIAGNOSE DER KLASSISCHEN SCHWEINEPEST 12
1.3.1 DIREKTE NACHWEISMETHODEN 12
1.3.2 INDIREKTE NACHWEISMETHODEN 13
1.3.3 ENZYM-LINKED-IMMUNOSORBENT-ASSAY 13
1.3.3.1 INDIREKTER ELISA 14
1.3.3.2 KOMPETITIVER ELISA 15
1.4 MARKERVAKZINEN GEGEN DIE KLASSISCHE SCHWEINEPEST 17
1.5 DAS CORE-PROTEIN 21
1.6 CORE IST NICHT ESSENTIELL 22
1.7 ZIEL DIESER ARBEIT 24
2 MATERIAL UND METHODEN 25
2.1 MATERIAL 25
V
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.1.1 ANTIGENE 25
2.1.2 ANTIKOERPER 25
2.1.2.1 DETEKTIONSANTIKOERPER 25
2.1.2.2 SEKUNDAERANTIKOERPER 25
2.1.3 SEREN 26
2.1.3.1 POSITIVES KONTROLLSERUM 26
2.1.3.2 NEGATIVES KONTROLLSERUM 26
2.1.3.3 SEREN AUS DEM TIERVERSUCH 26
2.1.3.4 NEGATIV-SEREN . .27
2.1.4 CHEMIKALIEN UND PUFFER 27
2.1.5 VERBRAUCHSMATERIALIEN 28
2.1.6 GERAETE 28
2.1.7 EINGESETZTE PUFFER UND LOESUNGEN 29
2.1.7.1 BESCHICHTUNGSPUFFER 29
2.1.7.2 BLOCKIERUNGSPUFFER T 29
2.1.7.3 WASCH- UND VERDUENNUNGSPUFFER 29
2.1.7.4 ZWISCHENFIXATION 29
2.1.7.5 FARBLOESUNG 30
2.1.7.6 STOPPLOESUNG 30
2.2 METHODEN 31
2.2.1 DURCHFUHRUNG EINES INDIREKTEN ELISAS 31
2.2.2 DURCHFUHRUNG EINES KOMPETITIVEN ELISAS 32
2.2.3 AUSWERTUNG EINES ELISAS 33
2.2.3.1 MESSUNG DER OPTISCHEN DICHTE 33
2.2.3.2 BERECHNUNG DER PROZENTUALEN INHIBITION 34
2.2.3.3 BERECHNUNG DES CUT-OFF -WERTES 34
2.2.3.4 BERECHNUNG DER SPEZIFITAET 34
2.2.3.5 BERECHNUNG DER SENSITIVITAET 35
3 ERGEBNISSE 36
3.1 AUSWAHL DER WICHTIGSTEN KOMPONENTEN 39
3.1.1 AUSWAHL VON DETEKTIONSANTIKOERPER, ANTIGEN UND SERUM 39
3.1.1.1 AUSWAHL DES DETEKTIONSANTIKOEIPERS 39
3.1.1.2 AUSWAHL DES ANTIGENS 41
VI
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.1.3 AUSWAHL DER SEREN 41
3.1.2 AUSWAHL DER KONZENTRATIONEN UND VERDUENNUNGEN 41
3.1.2.1 AUSWAHL DER ANTIGENKONZENTRATION 41
3.1.2.2 AUSWAHL DER KONZENTRATION DES DETEKTIONSANTIKOERPERS 42
3.1.2.3 AUSWAHL DER SERUMVERDUENNUNG 44
3.1.2.4 AUSWAHL DER VERDUENNUNG DES ZWEIT-ANTIKOERPERS 45
3.1.3 AUSWAHL WEITERER BESTANDTEILE 46
3.1.3.1 AUSWAHL DER MIKROTITER-PLATTEN 46
3.1.3.2 AUSWAHL DER PUFFERLOESUNGEN 46
3.1.3.3 AUSWAHL DER BLOCKIERUNGSLOESUNG 46
3.1.3.4 BESTIMMUNG DER ANZAHL DER WASCHSCHRITTE 46
3.1.3.5 AUSSCHLUSS UNSPEZIFISCHER BINDUNGEN 47
3.1.3.6 ZWISCHENFIXATION 47
3.2 UNTERSUCHUNG DER TESTSEREN 48
3.2.1 VERLAUFSKONTROLLE DER C-STAMM-GRUPPE 48
3.3 OPTIMIERUNG DER VERSUCHSBEDINGUNGEN 50
3.3.1 BESCHICHTUNG DER MIKROTITERPLATTEN 51
3.3.2 OPTIMIERUNG DER BLOCKIERUNG 51
3.3.3 INKUBATIONSBEDINGUNGEN DER SEREN 51
3.3.3.1 INKUBATIONSTEMPERATUR 51
3.3.3.2 INKUBATION AUF DEM SCHUETTLER 52
3.3.3.3 INKUBATIONSZEIT 53
3.3.3.4 AENDERUNG DER MENGENVERHAELTNISSE 53
3.3.4 INKUBATIONSBEDINGUNGEN DES DETEKTIONSANTIKOERPERS 54
3.3.4.1 INKUBATIONSZEIT 54
3.3.4.2 GLEICHZEITIGE INKUBATION DER SEREN MIT DEM DETEKTIONSANTIKOERPER
54
3.3.4.3 GLEICHZEITIGE INKUBATION DER SEREN MIT DETEKTIONS- UND
ZWEIT-ANTIKOERPER. 55
3.3.5 INKUBATIONSBEDINGUNGEN DES ZWEIT-ANTIKOERPERS 56
3.3.6 VERWENDUNG EINES DRITT-ANTIKOERPERS 56
3.3.7 DURCHFUHRUNG DES ELISAS NACH ABSCHLUSS DER OPTIMIERUNG 58
3.4 UNTERSUCHUNG DER TESTSEREN 59
3.4.1 VERLAUFSKONTROLLE DER C-STAMM-GRUPPE 59
3.4.2 VERLAUFSKONTROLLE DER KSPV ACORE PCR85-GRUPPEN 60
VII
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
3.5 VALIDIERUNG DES ELISAS 61
3.5.1 NEGATIV-SEREN 61
3.5.2 BILDUNG DES CUT-OFF -WERTES 62
3.5.3 BESTIMMUNG VON SPEZIFITAET UND SENSITIVITAET 63
4 DISKUSSION 64
4.1 KONZEPT DER ACORE-MARKERVAKZINE 64
4.2 BEWERTUNG DER ERGEBNISSE 65
4.3 SYSTEME ZUM NACHWEIS SPEZIFISCHER WILDTYP-ANTIKOERPER SIND
ESSENTIELLE BESTANDTEILE
DER MARKERIMPFSTOFF-ENTWICKLUNG 68
4.4 VERGLEICH DER ACORE-VAKZINE MIT ANDEREN DIVA-KONZEPTEN 70
5 ZUSAMMENFASSUNG 73
6 SUMMARY 74
7 LITERATURVERZEICHNIS 75
VIII
|
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