Posttranskriptionelle Regulation humaner Tropoelastin-mRNA:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2012
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Datensatz im Suchindex
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INHALTSVERZEICHNIS I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS V
1 EINLEITUNG 1
1.1 AUFBAU DER HUMANEN HAUT 1
1.2 AUFBAU UND FUNKTION ELASTISCHER FASERN 2
1.3 REGULATION DER BILDUNG ELASTISCHER FASERN 4
1.4 REGULATION DER TROPOELASTIN-EXPRESSION 5
1.4.1 TGF-SS ALS INDUKTOR DER TE MRNA EXPRESSION 6
1.4.2 MIR-29 ALS REPRESSOR DER TE MRNA EXPRESSION 9
1.5 REGULATION DER MRNA STABILITAET 10
1.5.1 MRNA-PROZESSIERUNG UND FUNKTION DES POLY(A) ENDES 10
1.5.2 FUNKTION DES POLY(A) ENDES BEI DER TRANSLATION 13
1.5.3 REGULATION DER DEADENYLIERUNG 14
1.6 ZIELSETZUNG 16
2 MATERIAL 17
2.1 CHEMIKALIEN UND WEITERE REAGENZIEN 17
2.2 ZELLKULTUR (ZUSAETZE UND INHIBITOREN) 17
2.3 KOMMERZIELLE KITS UND ENZYME 18
2.4 GROESSENSTANDARDS 18
2.5 ANTIKOERPER 19
2.6 OLIGONUKLEOTIDE 19
2.7 PLASMIDE 20
2.8 TAQMAN ASSAYS & LOW DENSITY ARRAYS 21
2.9 ZELLEN 22
2.10 BIOPSIEMATERIAL 22
2.11 BESONDERE SOFTWARE 24
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
3 METHODEN 25
3.1 KULTIVIERUNG VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN 25
3.2 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN 25
3.3 ISOLATION VON PRIMAEREN HUMANEN DERMALEN FIBROBLASTEN 26
3.4 VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNG FETALER UND ADULTER FIBROBLASTEN 26
3.5 BEHANDLUNG DERMALER FIBROBLASTEN MIT TGF-SS 26
3.5.1 24-STUENDIGE BEHANDLUNG UND UNTERSUCHUNG DER TE MRNA 26
3.5.2 ZEITREIHE UND UNTERSUCHUNG DER TE MRNA SOWIE MIR-29 27
3.5.3 UNTERSUCHUNG VON DURCH TGF-SS INDUZIERTEN PHOSPHORYLIERUNGEN 27
3.5.4 BEHANDLUNG MIT TGF-SS UND GLEICHZEITIGER EINSATZ VON
SIGNALWEG-INHIBITOREN 27
3.6 INHIBITION DER TRANSKRIPTION MIT DRB 28
3.7 RNA-ISOLATION UND DNASE-VERDAU 28
3.8 CDNA SYNTHESE MITTELS REVERSER TRANSKRIPTION 29
3.9 TAQMAN REAL TIME PCR 30
3.10 BESTIMMUNG DER LAENGE VON POLY(A) ENDEN UND GELELEKTROPHORESE 31
3.11 GELAUFREINIGUNG VON NUKLEINSAEUREN UND SEQUENZIERUNG 33
3.12 INHIBITION DER WIRKUNG VON MICRORNAS MITTELS ANTAGOMIRS 33
3.13 REPORTERASSAYS ZUR UNTERSUCHUNG DER WIRKUNG VON MICRORNAS 33
3.14 REPORTERASSAYS ZUR IDENTIFIZIERUNG TGF-SS RESPONSIVER CIS-ELEMENTE
34
3.15 KLONIERUNGEN 35
3.16 IN SITU HYBRIDISIERUNG ZUR LOKALISIERUNG VON MICRORNAS 35
3.17 HERSTELLUNG VON PROTEIN-LYSATEN UND KONZENTRATIONS-BESTIMMUNG 35
3.18 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE UND IMMUNOBLOT 36
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
III
4 ERGEBNISSE 38
4.1 DIE TE MRNA EXPRESSION IN HUMANER HAUT 38
4.1.1 DIE EXPRESSION VON BAUSTEINEN DER ELASTISCHEN FASER IST IN ADULTER
HUMANER HAUT REDUZIERT 38
4.1.2 BETEILIGUNG POSTTRANSKRIPTIONELLER MECHANISMEN AN DER REGULATION
DER TE MRNA 39
4.1.3 DIE POLY(A) ENDEN DER TE MRNA SIND IN ADULTER HAUT VERKUERZT 40
4.1.4 DEADENYLIERUNG KORRELIERT IN VERSCHIEDENEN ELASTISCHEN GEWEBEN MIT
DER REPRESSION DER TE MRNA 44
4.2 DIE TE MRNA EXPRESSION IN HUMANEN DERMALEN FIBROBLASTEN-KULTUREN 46
4.2.1 DERMALE FIBROBLASTEN ZEIGEN IN VITRO KEINE ALTERSABHAENGIGEN
UNTERSCHIEDE HINSICHTLICH DER EXPRESSION VON BESTANDTEILEN DER
ELASTISCHEN FASER 46
4.2.2 TGF-SS BEWIRKT IN HUMANEN DERMALEN FIBROBLASTEN EINE STABILISIERUNG
DER POLY(A) ENDEN DER TE MRNA 48
4.2.3 TGF-SS FUEHRT IN HUMANEN DERMALEN FIBROBLASTEN ZU EINER GESTEIGERTEN
HALBWERTSZEIT DER TE MRNA 50
4.2.4 TGF-SS FUEHRT IN HUMANEN DERMALEN FIBROBLASTEN ZU EINER GESTEIGERTEN
TRANSLATIONSEFFIZIENZ DER TE MRNA 52
4.3 MICRORNA INDUZIERTE TE MRNA DESTABILISIERUNG 54
4.3.1 DIE BEHANDLUNG MIT TGF-SS FUEHRT IN HUMANEN DERMALEN FIBROBLASTEN ZU
EINER REPRESSION VON MIR-29 54
4.3.2 DIE INHIBITION VON MIR-29A BEWIRKT EINE STABILISIERUNG DER POLY(A)
ENDEN DER TE MRNA 56
4.3.3 DIE EXPRESSION VON MIR-29 IST IN ADULTER HAUT ERHOEHT 57
4.3.4 DIE EXPRESSION VON MIR-29 IST IN ADULTEN ELASTISCHEN GEWEBEN
ERHOEHT 59
4.3.5 RELEVANZ VON MIR-29 FUER DIE REGULATION DER TE MRNA 60
4.4 TGF-SS INDUZIERTE TE MRNA STABILISIERUNG DURCH CIS-REGULATORISCHE
ELEMENTE UND TRANS-FAKTOREN 63
4.4.1 BETEILIGUNG VON P38 AN DER POSTTRANSKRIPTIONELLEN REGULATION DER
TE MRNA 63
4.4.2 BETEILIGUNG VON P38 AN DER TGF-SS VERMITTELTEN STABILISIERUNG DER
POLY(A) ENDEN DER TE MRNA 64
4.4.3 DIE TE MRNA BESITZT KEINE REGULATORISCHEN CIS-ELEMENTE, DIE IN
ABHAENGIGKEIT VON TGF-SS ZU EINER STABILISIERUNG DER TE MRNA FUEHREN 66
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
IV
4.5 TGF-SS INDUZIERTE TE MRNA STABILISIERUNG DURCH EINE GESTEIGERTE
TRANSLATIONSEFFIZIENZ 71
4.5.1 BETEILIGUNG VON MNK1 UND PI3K AN DER DURCH TGF-II VERMITTELTEN
INDUKTION DER TE MRNA 72
4.5.2 MNK1 UND DER PI3K-AKT-SIGNALWEG SIND AN DER TGF-SS VERMITTELTEN
STABILISIERUNG DER POLY(A) ENDEN DERTE MRNA BETEILIGT 74
4.5.3 DURCH TGF-SS INDUZIERTE AKTIVIERUNG VON ELF4E UND 4E-BP 77
4.5.4 DER MTOR INHIBITOR RAPAMYCIN BESITZT KEINEN EINFLUSS AUF DIE TE
MRNA 81
4.5.5 DIE TRANSLATIONS-INITIATION IST KRITISCH FUER DIE STABILISIERUNG
DER TE MRNA 82
5 DISKUSSION 84
5.1 IMPLIKATIONEN FUER DIE BEDEUTUNG DER VERFUEGBARKEIT VON TROPOELASTIN
FUER DIE HUMANE HAUT 86
5.2 DIE BEDEUTUNG VON TGF-SS FUER DIE REGULATION DER TE MRNA 89
5.3 REGULATION DER LAENGE DER POLY(A) ENDEN DURCH CIS-ELEMENTE UND
TRANS-FAKTOREN.... 92
5.4 DIE TRANSLATIONSSTEIGERNDE WIRKUNG VON TGF-SS UND DEREN EINFLUSS AUF
DIE MRNASTABILITAET 94
5.5 RELEVANZ DER TRANSLATION FUER DIE REGULATION DER TE MRNA IN HUMANER
HAUT 101
5.6 ABSCHLIESSENDE BETRACHTUNG UND AUSBLICK 103
6 ZUSAMMENFASSUNG 104
7 SUMMARY 106
8 LITERATURVERZEICHNIS 108
9 ANHANG 121
9.1 SEQUENZ HUMANER TE MRNA 121
9.2 SEQUENZIERUNGS-ERGEBNISSE 123
9.3 FUER KLONIERUNGEN VERWENDETE SEQUENZEN 124
9.3.1 3-UTR SEQUENZEN DER TE MRNA 124
9.3.2 ORF SEQUENZEN DER TE MRNA 126
VEROEFFENTLICHUNGEN VIII
DANKSAGUNG IX
LEBENSLAUF X
EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG XI
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