Einfluss von Hypoxie/Reoxygenierung auf die TGFb-Freisetzung & Signalwege in mikrovaskulären Endothelzellen:
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
Gießen, Lahn
VVB Laufersweiler Verlag
2012
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Ausgabe: | 1. Aufl. |
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS IV
1 EINLEITUNG 1
1.1 HERZINSUFFIZIENZ 1
1.2 TRANSFORMING GROWTH FACTOR SS (TGFSS) 2
1.2.1 AKTIVIERUNG VON LATENTEM TGFSS IN SEINE BIOAKTIVE FORM 2
1.2.2 TGFSS/SMAD-SIGNALKASKADE 4
1.3 ENDOTHELZELLEN 5
1.3.1 ENDOTHELZELLEN: AUFBAU UND FUNKTION 6
1.3.2 ENDOTHELZELLEN IM ZUSAMMENHANG MIT MYOKARDINFARKT 7
1.4 APOPTOSE 7
1.4.1 TGFSS UND APOPTOSE 9
1.5 GATA-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 9
1.5.1 GATA-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN IM ZUSAMMENHANG MIT TGFSS IM HERZEN 10
1.6 MIKRORNA 11
1.6.1 MIKRORNA BIOGENESE 11
1.6.2 REGULATION VON MIKRORNAS DURCH SMAD 12
1.6.3 MIKRORNA IM HERZEN 13
1.7 FRAGESTELLUNG DIESER ARBEIT 15
2 MATERIAL 16
2.1 CHEMIKALIEN 16
2.2 ANTIKOERPER FUER IMMUNOBLOTS 18
2.3 PRIMER FUER RT-PCR UND REAL TIME PCR 19
2.4 PUFFER UND LOESUNGEN 19
2.5 GERAETE UND LABORBEDARF 22
2.5.1 ALLGEMEIN VERWENDETE GERAETE 22
2.5.2 ZELLKULTUR 22
2.5.3 VERBRAUCHSMATERIALIEN 23
2.5.4 WESTERN BLOT 23
2.5.5 PCR 23
2.5.6 SOFTWARE 24
3 METHODEN 25
3.1 ISOLIERUNG VON KORONAREN ENDOTHELZELLEN DER RATTE 25
3.1.1 VERSUCHSTIERE 25
3.1.2 PRAEPARATION UND ZELLKULTUR VON MIKROVASKULAEREN ENDOTHELZELLEN AUS
DEM RATTENHERZ 25 3.1.3 PASSAGE VON MIKROVASKULAEREN ENDOTHELZELLEN 26
3.2 ISOLIERUNG VON VENTRIKULAEREN KARDIOMYOZYTEN 27
3.2.1 VERSUCHSTIERE 27
I
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.2 PRAEPARATION VENTRIKULAERER KARDIOMYOZYTEN AUS DER RATTE 27
3.2.3 VORINKUBATION DER KULTURSCHALEN FUER VENTRIKULAERE KARDIOMYOZYTEN 27
3.2.4 AUSPLATTIEREN DER VENTRIKULAEREN KARDIOMYOZYTEN 27
3.3 HYPOXIE/NORMOXIE UND REOXYGENIERUNG DER ENDOTHELZELLEN 28
3.4 PROTEINNACHWEIS 29
3.4.1 ZELLERNTE ZUR ISOLIERUNG VON GESAMTPROTEIN 29
3.4.2 PROTEINBESTIMMUNG NACH LOWRY 29
3.4.3 PROBENAUFBEREITUNG MITTELS LAEMMLIPUFFER 30
3.4.4 SDS-POLYACRYTAMID-GELELEKTROPHORESE 30
3.4.5 WESTERN BLOT 32
3.4.6 IMMUNDETEKTION DER TRANSFERIERTEN PROTEINE 33
3.5 NACHWEIS VON RNA 34
3.5.1 ZELLEMTE VON ENDOTHELZELLEN ZUR ISOLIERUNG VON GESAMT RNA 34
3.5.2 ISOLATION VON GESAMT-RNA 34
3.5.3 DNASE-VERDAU 35
3.5.4 MESSUNG DER RNA-KONZENTRATION 35
3.5.5 REVERSE TRANSKRIPTION (CDNA-SYNTHESE) 36
3.5.6 ALTERNATIVMETHODE ZUR DNASE-BEHANDLUNG UND CDNA-SYNTHESE 36
3.5.7 REALTIME RT-POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (REALTIME RT-PCR) 36
3.5.8 AUSWERTUNG DER PCR 39
3.5.9 DNA-GELELEKTROPHORESE 40
3.6 NACHWEIS VON MIKRORNA 41
3.6.1 POLYADENYLIERUNG MITTELS POLY-A SCHWANZ 41
3.6.2 CDNA SYNTHESE 42
3.6.3 QUANTITATIVE REALTIME-POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (QPCR) VON
MIKRORNA 42
3.7 NACHWEIS VON APOPTOSE 43
3.7.1 APOPTOSE NACHWEIS MITTELS HOE-ASSAY 43
3.8 STATISTIK 43
4 ERGEBNISSE 44
4.1 EINFLUSS VON HYPOXIE/REOXYGENIERUNG AUF DIE EXPRESSION VON TGFSS IN
MIKROVASKULAEREN ENDOTHELZELLEN 44
4.1.1 HYPOXIE/REOXYGENIERUNG STEIGERT DIE MRNA-EXPRESSION VON TGFSS, IN
ENDOTHELZELLEN.... 44 4.1.2 HYPOXIE/REOXYGENIERUNG ERNIEDRIGT ZU EINEM
FRUEHEN ZEITPUNKT DER REOXYGENIERUNG DIE MRNA-EXPRESSION VON TGFSS 2 45
4.1.3 HYPOXIE/REOXYGENIERUNG HAT KEINEN EINFLUSS AUF DIE MRNA-EXPRESSION
VON TGFSS 3. 46 4.1.4 HYPOXIE UND REOXYGENIERUNG STEIGERT DIE
PROTEINEXPRESSION DES TGFSS-VORLAEUFERPROTEINS .. IN MIKROVASKULAEREN
ENDOTHELZELLEN 47
4.2 EINFLUSS VON HYPOXIE UND REOXYGENIERUNG AUF SMAD SIGNALMOLEKUELE IN
MIKROVASKULAEREN ENDOTHELZELLEN 48
4.2.1 HYPOXIE/REOXYGENIERUNG STEIGERT DIE MRNA EXPRESSION VON SMAD2 IN
ENDOTHELZELLEN.. 48 4.2.2 HYPOXIE/REOXYGENIERUNG STEIGERT DIE MRNA
EXPRESSION VON SMAD3 IN ENDOTHELZELLEN.. 49 4.2.3 HYPOXIE/REOXYGENIERUNG
HAT KEINEN EINFLUSS AUF DIE SMAD4-MRNA-EXPRESSION IN ENDOTHELZELLEN 50
4.2.4 HYPOXIE/REOXYGENIERUNG ERHOEHT DIE SMAD7-MRNA-EXPRESSION IN
ENDOTHELZELLEN 51 4.2.5 ES FINDET EINE PHOSPHORYLIERUNG VON SMAD2 IN
ENDOTHELZELLEN UNTER HYPOXEN/REOXYGENIERTEN BEDINGUNGEN STATT 52
4.2.6 TGFSS-REZEPTOR-LNHIBITOR HEBT DIE PHOSPHORYLIERUNG VON SMAD2 IN
ENDOTHELZELLEN WIEDER AUF 53
II
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.7 ES FINDET KEINE PHOSPHORYLIERUNG VON SMAD3 IN ENDOTHELZELLEN UNTER
HYPOXEN/REOXYGENIERTEN BEDINGUNGEN STATT 54
4.3 EINFLUSS VON HYPOXIE UND REOXYGENIERUNG AUF
GATA-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN IN MIKROVASKULAEREN ENDOTHELZELLEN 55
4.3.1 HYPOXIE/REOXYGENIERUNG STEIGERT DIE GATA2-PROTEINEXPRESSION IN
ENDOTHELZELLEN 55 4.3.2 ES FINDET KEINE EXPRESSION VON GATA4 UND 6 IN
MIKROVASKULAEREN ENDOTHELZELLEN DER RATTE STATT 56
4.4 EINFLUSS VON HYPOXIE/REOXYGENIERUNG AUF MIKRORNAS IN ENDOTHELZELLEN
56 4.4.1 MIKRORNAI WIRD NICHT IN MIKROVASKULAEREN ENDOTHELZELLEN
EXPRIMIERT 57
4.4.2 HYPOXIE UND REOXYGENIERUNG ERHOEHT DIE EXPRESSION VON MIKRORNA21 57
4.4.3 HYPOXIE/REOXYGENIERUNG ERHOEHT DIE EXPRESSION VON MIKRORNA24 58
4.5 EINFLUSS VON HYPOXIE UND REOXYGENIERUNG AUF SMAD SIGNALMOLEKUELE IN
KARDIOMYOZYTEN 59
4.5.1 DURCH HYPOXIE UND REOXYGENIERUNG FREIGESETZTES TGFSS PHOSPHORYLIERT
SMAD2 PARAKRIN .. IN KARDIOMYOZYTEN 59
4.5.2 TGFSS-REZEPTOR-LNHIBITOR HEBT DIE PHOSPHORYLIERUNG VON SMAD2 IN
KARDIOMYOZYTEN WIEDER AUF 60
4.5.3 ES FINDET KEINE PHOSPHORYLIERUNG VON SMAD3 IN KARDIOMYOZYTEN STATT
61
4.6 EINFLUSS VON FREIGESETZTEM TGFSS AUF APOPTOSE VON KARDIOMYOZYTEN 62
4.6.1 DURCH HYPOXIE/REOXYGENIERUNG FREIGESETZTES TGFSS INDUZIERT PARAKRIN
APOPTOSE IN KARDIOMYOZYTEN 62
5 DISKUSSION 64
5.1 ENDOTHELZELLEN ALS QUELLE DER TGFSS-EXPRESSION 64
5.2 AUTOKRINE AKTIVIERUNG DER SMADS 64
5.3 INDUKTION VON GATA2 IM ZUSAMMENHANG MIT TGFSS 65
5.4 INDUKTION VON MIKRORNA21 UND 24 66
5.5 PARAKRINE WIRKUNG IN KARDIOMYOZYTEN 68
5.6 SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK 70
6 ZUSAMMENFASSUNG 72
7 SUMMARY 74
8 LITERATURVERZEICHNIS 75
9 DANKSAGUNG 89
III
|
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