Proteinanalyse klinisch relevanter Signalmoleküle aus Formalin-fixierten Tumorgeweben:
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY 7
1.1 ZUSAMMENFASSUNG 7
1.2 SUMMARY 8
2 EINLEITUNG 9
2.1 MOLEKULARE GRUNDLAGEN DER KREBSENTSTEHUNG 9
2.1.1 HER-FAMILIE 10
2.1.2 PI3K/AKT -SIGNALWEG 11
2.1.3 MAPK-SIGNALWEG 13
2.1.4 HITZESCHOCK-PROTEINE 14
2.1.5 STEROIDHORMONREZEPTOREN 15
2.1.6 PLASMINOGEN-AKTIVIERUNGSSYSTEM 16
2.2 PROTEINANALYSE AUS FORMALIN-FIXIERTEN GEWEBEN 18
2.2.1 GRUNDLAGEN DER FORMALIN-FIXIERUNG 18
2.2.2 ANALYSE VON MAKROMOLEKUELEN AUS FORMALIN-FIXIERTEN GEWEBEPROBEN 19
2.2.3 PROTEINEXTRAKTION AUS FFPE-GEWEBEN NACH BECKER 21
2.3 REVERSE PHASE PROTEIN-MIKROARRAY...... 21
2.3.1 VERFAHREN UND VERWENDUNG DES REVERSE PHASE PROTEIN-MIKROARRAYS 22
2.3.2 QUANTIFIZIERBARKEIT UND SENSITIVITAET 25
2.3.3 ANTIKOERPERVALIDIERUNG 26
2.3.4 AUSWERTUNG VON REVERSE PHASE PROTEIN-MIKROARRAYS 26
2.4 MAMMAKARZINOM 32
2.4.1 DIAGNOSE 32
2.4.2 KLASSIFIKATION UND ZIELGERICHTETE THERAPIE 33
2.5 OESOPHAGUSKARZINOM 37
2.5.1 DIAGNOSE UND THERAPIE 37
2.5.2 THERAPIEVERBESSERUNG BEIM OESOPHAGALEN ADENOKARZINOM 39
2.6 ZIELE DER ARBEIT 40
- I I -
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IMAGE 2
3 MATERIAL UND METHODEN 42
3.1 ALLGEMEINE PUFFER UND LOESUNGEN-.-............ 42
3.1.1 LOESUNGEN FUER DIE SDS-GELELEKTROPHORESE 42
3.1.2 LOESUNGEN FUER DIE IMMUNDETEKTION 43
3.1.3 LYSEPUFFER FUER GEFRIERGEWEBE 44
3.1.4 LYSEPUFFER FUER FFPE-GEWEBE 44
3.2 ALLGEMEINE REAGENZIEN UND CHEMIKALIEN 45
3.3 KOMMERZIELLE ANALYSESYSTEME UND VORGEFERTIGTE LOESUNGEN 46
3.4 VERBRAUCHSMATERIAL 46
3.5 ANTIKOERPER 47
3.6 REKOMBINANTE PROTEINE 48
3.7 ELISA-KITS 48
3.8 ZELLLINIEN 48
3.9 GERAETE 49
3.10 SOFTWARE 49
3.11 EINGESETZTE GEWEBEPROBEN 50
3.11.1 GEWEBE FUER DIE OPTIMIERUNG DER PROTEINEXTRAKTION AUS
FORMALIN-FIXIERTEN GEWEBEN 50
3.11.2 MAMMAKARZINOMGEWEBEFUERDIE UPA UND PAI-1 ASSOZIIERTE
SIGNALWEGSANALYSE 51
3.11.3 GEWEBE FUER DEN VERGLEICH VON PRIMAERTUMOREN DES MAMMAKARZINOMS UND
ASSOZIIERTER
LYMPHKNOTENMETASTASEN 52
3.11.4 MAMMAKARZINOMGEWEBE ZUR RPPA ANALYSE DER HER-REZEPTOREN 54
3.11.5 GEWEBE DES OESOPHAGUSKARZINOMS ZUR MARKERANALYSE 55
3.11.6 EINVERSTAENDNISERKLAERUNG DER PATIENTEN 56
3.12 HERSTELLUNG VON FFPE-GEWEBEBLOECKEN 56
3.13 HERSTELLUNG VON FFPE-ZELLPELLETS 57
3.14 PROTEINEXTRAKTION 58
3.14.1 PROTEINEXTRAKTION AUS FORMALIN-FIXIERTEN UND IN PARAFFIN
EINGEBETTETEN GEWEBEN 58
3.14.2 PROTEINEXTRAKTION AUS SCHOCKGEFRORENEN GEWEBEN 58
3.14.3 PROTEINEXTRAKTION AUS ZELLKULTUREN 59
IMAGE 3
3.15 HAEMATOXYLIN-EOSIN-FAERBUNG 59
3.16 METHODEN ZUR UMPUFFERUNG DER PROTEINLYSATE 60
3.16.1 AUFREINIGUNG UEBER ENTSALZUNGSSAEULEN 60
3.16.2 DIALYSE 60
3.16.3 SDS-AUSFAELLUNG 61
3.16.4 PROTEINFAELLUNGEN 61
3.17 GESAMTPROTEINBESTIMMUNG 63
3.17.1 BRADFORD-ASSAY 63
3.17.2 SYPRO-RUBY-FAERBUNG 63
3.18 ENZYMGEKOPPELTER IMMUNADSORPTIONSASSAYS (ELISA) 64
3.18.1 FEMTELLE ELISA 64
3.18.2 ELISA GEGEN DENATURIERTES UPA UND PAI-1 65
3.19 WESTERN BLOT 66
3.19.1 SDS-GELELEKTROPHORESE 66
3.19.2 TRANSFER DER PROTEINE 67
3.19.3 IMMUNDETEKTION 68
3.20 REVERSE PHASE PROTEIN-MIKROARRAY 68
3.20.1 SPOTTEN DER PROTEINLYSATE 68
3.20.2 IMMUNDETEKTION 69
3.20.3 QUANTIFIZIERUNG DER INTENSITAET MIT MICROVIGENE 69
3.20.4 BESTIMMUNG ABSOLUTER PROTEINKONZENTRATIONEN 71
3.21 STATISTISCHE METHODEN 71
3.21.1 STATISTISCHE TESTS UND KORRELATIONSANALYSEN 71
3.21.2 HIERARCHISCHE CLUSTERANALYSEN 73
3.21.3 UEBERLEBENSANALYSEN 73
3.21.4 MULTIPLES TESTEN 74
4 ERGEBNISSE 75
4.1 OPTIMIERUNG DER PROTEINEXTRAKTION AUS FORMALIN-FIXIERTEN UND
PARAFFIN-EINGEBETTETEN GEWEBEN
75
4.1.1 VERBESSERUNG DER PUFFERZUSAMMENSETZUNG 75
4.1.2 OPTIMIERUNG DER TEMPERATURSCHRITTE 84
- I V -
IMAGE 4
4.2 ETABLIERUNG DES REVERSE PHASE PROTEIN-MIKROARRAYS 85
4.2.1 ANTIKOERPERVALIDIERUNG 85
4.2.2 NACHWEIS DER REPRODUZIERBARKEIT 87
4.2.3 UEBERPRUEFUNG DER RESULTATE DES REVERSE PHASE PROTEIN MIKROARRAYS 90
4.3 DETEKTION DER PROGNOSTISCHEN FAKTOREN UPA UND PAI-1 IN
FORMALIN-FIXIERTEN UND PARAFFIN
EINGEBETTETEN GEWEBEN 91
4.3.1 PROTEINLYSATE AUS FFPE-GEWEBEN IM KLINISCHEN ELISA 92
4.3.2 VERRINGERUNG DER SDS UND SS-MERCAPTOETHANOL-KONZENTRATION 94
4.3.3 UMPUFFERUNG DURCH FAELLUNG 95
4.3.4 ENTWICKLUNG EINES ELISA GEGEN DENATURIERTES UPA UND PAI-1 97
4.4 ANALYSE VON UPA/PAI-1 ASSOZIIERTEN SIGNALWEGEN IM MAMMAKARZINOM 99
4.4.1 KORRELATION DER UPA UND PAI-1 EXPRESSION MIT
SCHLUESSEL-SIGNALMOLEKUELEN DER
TUMORPROGRESSION IN MAMMAKARZINOMEN 99
4.4.2 UEBERPRUEFUNG DER BETEILIGUNG VON UPA IM ERK/STAT- UND PAI-1 IM
AKT-SIGNALWEG 102
4.4.3 ANALYSE DER SIGNALWEGSAKTIVIERUNG IN EINZELNEN TUMOREN 103
4.5 EXPRESSIONSVERGLEICH ZWISCHEN PRIMAERTUMOR UND KORRESPONDIERENDER
LYMPHKNOTENMETASTASE
DES MAMMAKARZINOM 105
4.6 UNTERSUCHUNG DER EXPRESSION DER PROTEINE DER HER-FAMILIE IM
MAMMAKARZINOM 108
4.6.1 BESTIMMUNG DES HER2-STATUS MITTELS REVERSE PHASE
PROTEIN-MIKROARRAY 108
4.6.2 REANALYSE DER NICHT-UEBEREINSTIMMENDEN FAELLE 111
4.6.3 UNTERSUCHUNG DES AKTIVIERUNGSSTATUS DER HER-REZEPTOREN 112
4.7 ANALYSE MOEGLICHER MARKERPROTEINE BEIM ADENOKARZINOM DES OESOPHAGUS
116
4.7.1 SCHWELLENWERTANALYSE 17 OESOPHAGUS-RELEVANTER PROTEINE 117
4.7.2 HIERARCHISCHE CLUSTERANALYSE IN BEZUG AUF PROTEINE DER HER-FAMILIE
SOWIE AUF HSP27 UND
DESSEN PHOSPHORYLIERUNGEN 120
5 DISKUSSION 124
5.1 VERBESSERTE PROTEINEXTRAKTION AUS FORMAIIN-FIXIERTEN UND
PARAFFIN-EINGEBETTETEN GEWEBEN. 124
5.1.1 VORTEILE DES EXTRAKTIONSPUFFERS LMA 124
5.1.2 OPTIMIERTE EXTRAKTIONSBEDINGUNGEN 128
5.2 STAERKEN UND SCHWAECHEN DES REVERSE PHASE PROTEIN-MIKROARRAYS 129
5.2.1 ANTIKOERPERVALIDIERUNG 129
5.2.2 REPRODUZIERBARKEIT DES REVERSE PHASE PROTEIN MIKROARRAYS 131
5.2.3 WIDERSPIEGELUNG DER BIOLOGISCHEN REALITAET DURCH DEN RPPA 132
IMAGE 5
5.3 ANALYSE VON UPA UND PAI-1 AUS FORMALIN-FIXIERTEN GEWEBEN MITTELS
ELISA 133
5.4 DIE ROLLE VON UPA UND PAI-1 IM MAMMAKARZINOM 135
5.4.1 DISKUSSION DER ERHALTENEN WERTE 135
5.4.2 PAI-1 ASSOZIIERTE SIGNALWEGSMOLEKUELE 136
5.4.3 UPA ASSOZIIERTE SIGNALWEGSPROTEINE .140
5.5 UNTERSCHIEDE ZWISCHEN PRIMAERTUMOR UND LYMPHKNOTEN-METASTASEN DES
MAMMAKARZINOMS. 143
5.5.1 EXPRESSIONSUNTERSCHIEDE VON UPA UND PAI-1 144
5.5.2 EXPRESSIONSUNTERSCHIEDE VON ERA UND PR 144
5.5.3 EXPRESSIONSUNTERSCHIEDE VON HER2 145
5.6 ETABLIERUNG EINES QUANTITATIVEN ANSATZES ZUR HER2-BESTIMMUNG IM
MAMMAKARZINOM 146
5.7 PROGNOSTISCHE BEDEUTUNG DER AKTIVIERTEN FORMEN DER HER-PROTEINE IM
MAMMAKARZINOM 149
5.7.1 NACHWEIS VON P-HER2-EXPRESSION IN KLINISCH HER2-NEGATIVEN
MAMMAKARZINOMEN 149
5.7.2 AKTIVIERUNGSSTATUS DER HER-REZEPTOREN IM ZUSAMMENHANG MIT DER
HER2-EXPRESSION 151
5.8 IDENTIFIKATION NEUER MOLEKULARER MARKER IM ADENOKARZINOM DES
OESOPHAGUS 152
6 AUSBLICK 154
7 LITERATURVERZEICHNIS 155
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 165
TABELLENVERZEICHNIS 167
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 169
PUBLIKATIONEN 171
DANKSAGUNG 173
- V I -
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