Untersuchungen zur Interaktion des adenoviralen Proteins E3-14.7K und der Initiatorcaspase-8:
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 APOPTOSE 1
1.2 DIE INDUKTION DER APOPTOSE 2
1.2.1 DER INTRINSISCHE APOPTOSEWEG 2
1.2.2 DER EXTRINSISCHE APOPTOSEWEG 3
1.3 CASPASEN UND IHRE SIGNALKASKADEN 6
1.3.1 CASPASE-8 8
1.4 TNF UND DIE TNF-REZEPTOREN 1 UND 2 9
1.4.1 TNF-SIGNALTRANSDUKTION DURCH DEN TNFR1 10
1.5 VIREN UND APOPTOSE 13
1.5.1 STRATEGIEN DER VIRALEN APOPTOSEINHIBITION 13
1.6 ADENOVIREN 16
1.6.1 DAS ADENOVIRALE GENOM UND SEINE E3-REGION 17
1.6.2 E3-14.7K 18
2. ZIEL DER ARBEIT 20
3. MATERIAL UND METHODEN 21
3.1 MATERIAL 21
3.1.1 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 21
3.1.2 PUFFER UND LOESUNGEN 22
3.1.3 VERBRAUCHSMATERIALIEN 23
3.1.4 GERAETE 23
3.1.5 KITS 24
3.1.6 ENZYME 24
3.1.7 ZELLLINIEN/ BAKTERIENSTAEMME 25
3.1.8 PRIMER 25
3.1.9 PLASMIDE 26
3.1.10 SEQUENZIERUNG 26
3.2 METHODEN 27
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3.2.1 MOLEKULARBIOLOGIE 27
3.2.1.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 27
3.2.1.2 KINASIERUNG 28
3.2.1.3 KLONIERUNG 29
3.2.1.4 TRANSFORMATION IN KOMPETENTE ZELLEN 30
3.2.1.7 DNA-RESTRIKTION 31
3.2.2 ZELLKULTUR 32
3.2.2.1 KULTIVIERUNG DER ZELLEN 32
3.2.2.2 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 33
3.2.2.3 TRANSFEKTION 33
3.2.2.4 CASPASE-8-LNHIBITION 35
3.2.2.5 TRANSFEKTIONSKONTROLLE 35
3.2.2.6 ZYTOTOXIZITAETSASSAY 35
3.2.2.7 MAMMALIAN TWO-HYBRID ASSAY 36
3.2.2.8 HERSTELLUNG VON PROTEINLYSATEN 39
3.2.2.9 QUANTITATIVE PROTEINBESTIMMUNG 40
3.2.2.10 IMMUNPRAEZIPITATION 41
3.2.2.11 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 41
3.2.2.12 WESTERN-BLOT 43
3.2.2.13 ANTIKOERPER 44
4. ERGEBNISSE 45
4.1 DARSTELLUNG DER 14.7K-MEDIIERTEN TNF-RESISTENZ IM
ZYTOTOXIZITAETSASSAY 45
4.2 HEMMUNG DER APOPTOSE IN H1299/14.7K DURCH BLOCKADE DER
CASPASE-8-KASKADE 46
4.3 INHIBITION DER APOPTOSE DURCH 14.7K NACH CASPASE-8UEBEREXPRESSION 49
4.4 UNTERSUCHUNG DER INTERAKTION VON 14.7K UND CASPASE-8 MIT HILFE
DES MAMMALIAN TWO-HYBRID ASSAYS 51
4.5 EXPRESSIONSNACHWEIS DER CASPASE-8-KONSTRUKTE 59
4.5.1 DETEKTIERTE FUSIONSPROTEINE 60
IMAGE 3
4.5.2 NICHT-DETEKTIERTE FUSIONSPROTEINE 61
5. DISKUSSION 69
5.1 MAMMALIAN TWO-HYBRID ASSAY 70
5.1.1 CASPASE-8 IN PCMV-AD 71
5.1.2 CASPASE-8 IN PCMV-BD 72
5.1.3 BINDUNG DER CASPASE-8-DEDS UNTEREINANDER 73
5.1.4 CASPASE-8 UND FADD 74
5.1.5 CASPASE-8 UND CRMA 74
5.2 WESTERN-BLOT-ANALYSEN 75
6. ZUSAMMENFASSUNG 77
7. ANHANG 80
7.1 ABKUERZUNGEN 80
7.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 82
7.3 TABELLENVERZEICHNIS 82
8. LITERATURVERZEICHNIS 84
9. DANKSAGUNG 94
10. LEBENSLAUF 95
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