Untersuchungen zur Genregulation der chloroplastidären Ascorbat-Peroxidasen sAPX und tAPX in Arabidopsis thaliana:
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2012
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Z U S A M M E N F A S S U N G I
A B K UE R Z U N G S V E R Z E I C H N I S III
1. GINLEITUNG 1
1.1 ENDOSYMBIOTISCHER URSPRUNG DER CHLOROPLASTEN U N D MITOCHONDRIEN 1
1.2. VOM ENDOSYMBIONTEN ZUR ORGANELLE 3
1.3. RETROGRADERSIGNALWEG 5
1.3.1. DER MG-PROTOPORPHYRIN IX-ABHAENGIGE SIGNALWEG 7
1.3.2. REDOX-SIGNALWEG 8
1.3.3. ROS SIGNALWEG 7
1.4. ENTSTEHUNG VON OXIDATIVEM STRESS 11
1.4.1. ENDOGENE QUELLEN VON ROS 12
1.4.2. ENTSTEHUNG REAKTIVER SAUERSTOFF-SPEZIES IN CHLOROPLASTEN 13
1.4.3. ZELLULAERE ENTGIFTUNGSSYSTEME VON REAKTIVEN SAUERSTOFF-SPEZIES 14
1.4.4. FUNKTIONEN NIEDERMOLEKULARER ANTIOXIDANTIEN 14
1.4.5. ENZYMATISCHE ANTIOXIDANTIEN 17
1.5. REGULATION D E R GENAKTIVITAET D U R C H TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 23
1-6. ZIELSETZUNG D E R ARBEIT 26
2. MATERIAL U N D M E T H O D E N 28
2.1. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 2 8
2.1.2. AMPLIFIKATION VON SAPX- UND TAPX-PROMOTORFRAGMENTEN 28
2.1.3. AUFREINIGUNG DER AMPLIFIZIERTEN DNA 30
2.1.4. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 30
2.1.5. DNA-GEL-EXTRAKTION 30
2.1.6. PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION 31
2.1.7. DNA-ETHANOL-FAELLUNG 31
2.1.8. PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 31
2.1.9. DNA-HYDROLYSE MITTELS RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 31
2.1.10. LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 32
2.1.11. HERSTELLUNG KOMPETENTER E.COLI ZELLEN 32
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IMAGE 2
2.1.12. HERSTELLUNG VON LB-AGARPLATTEN 33
2.1.13. TRANSFORMATION VON PLASMIDEN IN KOMPETENTE E.COLI ZELLEN 3 3
2.1.14. HERSTELLUNG EINER GLYCERIN-STAMMKULTUR 34
2.1.15. E. CO/R -COLONY-PCR 34
2.1.16. MAXI PRAEPARATION DER PLASMID DANN AUS E.COLI 34
2.1.7. DNA-SEQUENZIERUNG 35
2.2.1. STERILISATION VON ARABIDOPSIS THALIANA SAMEN 36
2.2.2. STERILANZUCHT VON ARABIDOPSIS THALIANA KEIMLINGEN 36
2.2.3. AKTIVIERUNG VON STRESSINDUZIERTEN GENEN IN A. THALIANA KEIMLINGEN
36
2.2.4. ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN AUS PFLANZENMATERIAL 37
2.2.5. RNA ISOLIERUNG AUS PFLANZENMATERIAL 38
2.2.6. FORMALDEHYD-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON R N A 39
2.2.7. AUFREINIGUNG VON POLY A + R N A AUS GESAMT R N A 39
2.2.8. ANALYTISCHE CDNA-ERSTSTRANGSYNTHESE 4 0
2.3. CDNA-BANKSYNTHESE FUER D A S HEFE-ONE-HYBRID UND TWO-HYBRID-SYSTEM 4
0
2.3.1. DIE CDNA-ERSTSTRANG-SYNTHESE 42
2.3.2. DIE CDNA-ZWEITSTRANGSYNTHESE 4 3
2.3.3. REINIGUNG DER DOPPELSTRAENGIGEN CDNA 4 3
2.3.4. AMPLIFIZIERUNG DER CDNA-BIBLIOTHEK 4 4
2.3.5. ANALYSE DER CDNA-BANK DURCH R T - P C R 4 4
2.3.6. CHARAKTERISIERUNG DER ERSTELLTEN CDNA-BANK 4 5
2.3.6.1. CDNA BANK-CHARAKTERISIERUNG MITTELS HEFE-COLONY-PCR 4 5
2.4. PROTEINEXPRESSION IN E.COLI UND AUFREINIGUNG REKOMBINANTER PROTEINE
4 5
2.4.1. KLONIERUNG DER GENE HETEROGENE EXPRESSION IN E.COLI 45
2.4.2. KULTIVIERUNG DER ECO//-ZELLEN 4 7
2.4.3. AUFREINIGUNG REKOMBINANTER PROTEINE 4 7
2.4.3.1. PROTEINAUFREINIGUNG MITTELS NI-NTA-AGAROSE 4 8
2.4.3.2. PROTEINAUFREINIGUNG MIT HILFE VON GLUTATHION-SEPHAROSE 4 8
2.5. PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 49
2.5.1. QUANTIFIZIERUNG DES PROTEINGEHALTES 4 9
2.5.2. SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 49
2.5.3. DENATURIERENDE SDS-PAGE 50
2.5.4. WESTERN-BLOT ANALYSE 50
IMAGE 3
2.5.4.1. SEMI-DRY-BLOTTING 50
2.5.4.2. IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS VON PROTEINEN 51
2.5.4.3. NACHWEIS DER PROTEINE DURCH CHEMOLUMINESZERIZ 51
2.5.5. REDOX-ABHAENGIGER PULLDOWNASSAY 52
2.5.6. NICHT-RADIOACTIVES ELECTROMOBILITAETS SHIFT ASSAY 52
2.6. GEWINNUNG VONPROTOPLASTEN AUS DER ARABIDOPSIS THALIANA -ZELLLINIE
AT7 53
2.7. ARBEIT MIT SACCHAROMYCES CEREVISIAE
2.7.1. ANZUCHTBEDINGUNGEN FUER S. CEREVISIAE ^
2.7.2. DAS HEFE-ONE-UND TWO-HYBRID-SYSTEM 55
2.7.3. HEFETRANSFORMATIONEN ^
2.7.4. SMALL-SCALE DNA-TRANSFORMATION IN S. CEREVISIAE J G
2.7.5. EINSTELLUNG DER OPTIMALEN 3-AMINO-L, 2, 4-TRIAZOL-KONZENTRATION
57
2.7.6. HEFETRANSFORMATION M I T D E R C D N A - B A N K 57
2.7.7. BESTIMMUNG DER TRANSFORMATIONSEFLFIZIENZ 59
2.7.8. LANGFRISTIGE LAGERUNG VON HEFESTAEMMEN 59
2.7.9. REAKTIVIERUNG VON EINGEFRORENEN HEFESTAEMMEN 5 9
2.7.10 PLASMID-MINIPREP AUS HEFE GP
2.8. 2.8. F R E T - M E S S U N G E N U N D PROTEINLOKALISATION 60
2-9. DNA-SEQUENZANALYSE 61
3 . E R G E B N I S S E U N D D I S K U S S I O N 63
3.1. DESIGN DER ZIELELEMENTE FUER DEN HEFE-ONE-HYBRID-SCREEN 63
3.1.1. AUSWAHL VON SAPX UND TAPX-PROMOTOTFRAGMENTEN FUER DEN HEFE-ONE- 63
HYBRID-SCREEN
3.2. PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG DES HEFESTAMMES YL 87 65
3.3. EINSTELLUNG DER OPTIMALEN KONZENTRATION AN 3-AMINO-L,2,4-TRIAZOL 66
3.4. SYNTHESE EINER CDNA-BANK AUS KEIMLINGEN VON ARABIDOPSIS THALIANA 69
3.4.1. RNA-EXTRAKTION AUS KEIMLINGEN 69
3.4.2. UNTERSUCHUNG D E R ANALYTISCHEN CDNA 70
3.4.3. HERSTELLUNG DER CDNA BANK 71
3.4.4. OPTIMIERUNG D E R CDNA-BANK-AMPLIFIKATION 73
3.3.5. TRANSFORMATION VON VEKTOR-DNA IN S. CEREVISIAE 74
IMAGE 4
3.4.6. CHARAKTERISIERUNG DER ERSTELLTEN CDNA-BANK 74
3.5. IDENTIFIZIERUNG POSITIVER HEFEKLONE DES ONE -HYBRID-SCREEN 75
3.5.1. FALSCH POSITIVE SIGNALLE IM HEFE-ONE-HYBRID-SYSTEM. 77
3.5.2. INTERAKTIONSPARTNER D E R S A P X - B Z W TAPX-PROMOTOREN 78
3.5.2.1. BINDUNG DES TRANSKRIPTIONSFAKTORS BHLH 106 AN DAS
PROMOTORFRAGMENT 79
TAPX-1
3.5.2.2. PUTATIVER TRANSKRIPTIONSFAKTOR SAP2 79
3.5.2.3. TRANSKRIPTIONSFAKTOR ANAC089 81
3.5.2.4. IN VIVO IDENTIFIZIERUNG DES DNA-BINDEELEMENTES VON ANAC089 82
3.5.3. IDENTIFIZIERUNG D E R INTERAKTIONSPARTNER FUER D A S SAP2 PROTEIN
85
3.6. SUBZELLULAERE LOKALISATION DER IDENTIFIZIERTEN PROTEINE IN
PROTOPLASTEN VON 88
A. THALIANA
3.6.1. LOKALISATION VON ANAC089 IN A.THALIANA 89
3.6.2. SUBZELLULAERE LOKALISATION VON SAP2 IN A. THALIANA 94
3.6.3. SUBZELLULAERE LOKALISATION VON CML49 IN A.THALIANA 96
3.6.4. SUBZELLULAERE LOKALISATION DES PROTEINS BHLH106 IN A.THALIANA 97
3.7. TRANSAKTIVIERUNGSTESTS DES S A P X - U N D TAPX-PROMOTORS 97
3.7.1. LOKALISATION REGULATORISCHER CIS-ELEMENTE IM SAPX-PROMOTOR 99
3.7.2. LOKALISATION REGULATORISCHER CIS-ELEMENTE IM TAPX-PROMOTOR 102
3.8. IN VIVO FRET-ANALYSE VON PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONEN IN
A.THALIANA 104
3.8.1. UNTERSUCHUNG ZUR HOMODIMERBILDUNG DES CLM49-PROTEINS IN VIVO 105
3.8.2. IN VIVO-INTERAKTION ZWISCHEN CLM49 UND SAP2 107
3.8.3. EXPRESSION UND AUFREINIGUNG REKOMBINANTER PROTEINE 109
3.8.4. NACHWEIS DER PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTION ZWISCHEN SAP2 UND CML49
110
IM PULLDOWN ASSAY 112
3.9. UNTERSUCHUNG ZUR DNA-PROTEIN-INTERAKTION DER IDENTIFIZIERTEN
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN. 112
3.9.1. IN VF7RO-DNA-PROTEIN-INTERAKTIONSANALYSE DER IDENTIFIZIERTEN
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN. 112
3.9.2. UNTERSUCHUNG DER ANAC089-DNA-INTERAKTION IN VIVO 114
4. AUSSICHT 116
5. LITERATURVERZEICHNIS 117
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