Regulation und Funktion von AtCPK21 und AtCPK23 in der schnellen ABA-Signaltransduktion und adaptiven abiotischen Stressantwort:
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS VIII
TABELLENVERZEICHNIS X
ALLGEMEINES ABKUERZUNGSVERZEICHNIS XI
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS DER AMINOSAEUREN XV
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS NUKLEOBASEN DER DNA XVI
1 EINLEITUNG 1
1.1 PFLANZENSIGNALTRANSDUKTION: CA 2+ ALS SEKUNDAERER BOTENSTOFF 1
1.2 CA 2+ -ABHAENGIGE PROTEINKINASE CDPK 2
1.2.1 CDPK-PROTEINFAMILIE IN A. THALIANA 2
1.2.2 BIOCHEMISCHE AKTIVIERUNG VON CDPKS 4
1.2.2.1 DIE EF-HAND, EIN CA 2+ -BINDEMOTIV 4
1.2.2.1.1 DAS EF-HAND-PAAR 6
1.2.2.1.2 CA 2+ -SELEKTIVITAET BEI DER EF-HAND 7
1.2.2.2 CA 2+ -ABHAENGIGE KONFORMATIONSAENDERUNG VON CDPKS 8
1.2.2.3 AUTOPHOSPHORYLIERUNGSABHAENGIGE CDPK-AKTIVITAET 10
1.3 ABIOTISCHER STRESS 11
1.3.1 WASSERMANGEL ALS TEIL DES ABIOTISCHEN STRESSES MIT FOKUS AUF
OSMOTISCHEM STRESS 11
1.4 ABA, DAS SIGNALHORMON FUER ABIOTISCHEN STRESS 13
1.4.1 FUNKTION DER ABA 13
1.4.2 DER ABA-REZEPTOR UND DIE ABA-SIGNALTRANSDUKTION 14
1.4.3 ABA-ABHAENGIGE REGULATION DER STOMATA 18
1.5 GENREGULATION IN ABHAENGIGKEIT VON ABA UND ABIOTISCHEM STRESS 19
1.6 CDPKS IN DER ABIOTISCHEN STRESS- UND ABA-ANTWORT 21
1.7 ZIELSETZUNGEN 27
2 MATERIAL UND METHODEN 28
2.1 MATERIAL 28
2.1.1 CHEMIKALIEN 28
2.1.2 VERWENDETE ENZYME, PROTEINE, PEPTIDE, ANTIKOERPER UND
GROESSENSTANDARDS 28
2.1.3 VERWENDETET MEDIEN 29
2.1.4 VERWENDETE E.CO// -STAEMME 29
2.1.5 VERWENDETE PFLANZENLINIEN 30
2.1.6 VEKTOREN UND PLASMIDE 31
2.1.7 VERWENDETE PROGRAMME 35
2.2 METHODEN 35
III
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IMAGE 2
2.2.1 METHODEN ZUM ARBEITEN MIT A. F/7A// A/7A-PFLANZEN 35
2.2.1.1 ANZUCHT UND SELEKTION VON A. F/7A// ANA-PFLANZEN 35
2.2.1.2 A. THALIANA- SAMEN-STERILISIERUNG 36
2.2.1.3 STRESSVERSUCHE AN A. FA?A//ANA-KEIMLINGEN 36
2.2.1.4 HERSTELLUNG VON POLYETHYLENGLYCOL- (PEG-) PLATTEN NACH (VERSLUES
ET AL. 2006) 37
2.2.2 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 37
2.2.2.1 ANZUCHT VON E. COLI 37
2.2.2.2 HITZESCHOCKTRANSFORMATION CHEMOKOMPETENTER E.CO//-ZELLEN
(DH10B/BL21 DE3) 37
2.2.2.3 HERSTELLUNG CHEMOKOMPETENTER E.CO// -ZELLEN (DH10B/BL21 DE3) 38
2.2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN - NUKLEINSAEUREN 38
2.2.3.1 E.CO// -PLASMID-DNA-MINIPRAEPARATION 38
2.2.3.2 E.CO//-PLASMID-DNA-MAXIPRAEPARATION 38
2.2.3.3 DNA-ISOLIERUNG AUS A. THALIANA NACH (EDWARDS ET AL. 1991) 38
2.2.3.4 RNA-ISOLIERUNG AUS A. THALIANA MIT DER TRIZOL-METHODE NACH
(CHOMCZYNSKI UND SACCHI 2006) 39
2.2.3.5 DNASE-BEHANDLUNG DER RNA 39
2.2.3.6 REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) 40
2.2.3.7 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) NACH (MULLIS ET AL. 1992) 40
2.2.3.8 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 41
2.2.3.9 DNA-EXTRAKTION AUS AGAROSEGELEN 41
2.2.3.10 AUFREINIGUNG EINES PCR-PRODUKTS 41
2.2.3.11 QUANTIFIZIERUNG DER NUKLEINSAEUREKONZENTRATION 41
2.2.4 KLONIERUNG 41
2.2.4.1 RESTRIKTIONSVERDAU VON PLASMIDEN 44
2.2.4.2 DEPHOSPHORYLIERUNG 44
2.2.4.3 LIGATION 45
2.2.4.4 MUTAGENESE-PCR NACH (WEINER ET AL. 1994) 45
2.2.4.5 SEQUENZIERUNG DER DNA 46
2.2.5 MOLEKULARE METHODEN - PROTEIN 46
2.2.5.1 PROTEINEXPRESSION IN E. COLI UNTER VENWENDUNG EINES
IPTG-INDUZIERBAREN SYSTEMS 46
2.2.5.2 ZELLAUFSCHLUSS VON E. COLI 46
2.2.5.3 GST-AUFREINIGUNG 47
2.2.5.4 AUFREINIGUNG DER CPK21-CLD FUER SURFACE PLASMA RESONANCE -
(SPR-) INTERAKTIONSANALYSEN 48
2.2.5.4.1 AUFREINIGUNG HIS-MARKIERTER PROTEINE 49
IV
IMAGE 3
2.2.5.4.2 ENTFERNUNG DER HIS-MARKIERUNG DURCH DIE PROTEASE THROMBIN 49
2.2.5.4.3 PHENYLSEPHAROSE 50
2.2.5.4.4 UMPUFFERUNG UEBER EINE ENTSALZUNGSSAEULE 50
2.2.5.4.5 PROTEIN-AUFKONZENTRIERUNG DURCH GROESSENAUSSCHLUSSFILTRATION 50
2.2.5.4.6 PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG 51
2.2.5.5 TRANSIENTE PROTEIN-EXPRESSION IN A. F/7A// A/7A-PROTOPLASTEN 51
2.2.5.6 PRD29SS;:Z_L/C-EXPRESSIONSMESSUNGEN NACH YOO ET AL. (2007) 53
2.2.5.7 ZELLAUFSCHLUSS VON A. F/7A// ANA-PROTOPLASTEN UND STREP-
AFFINITAETSCHROMATOGRAFIE 53
2.2.5.8 DENATURIERENDE SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 54
2.2.5.9 COOMASSIE-FAERBUNG 55
2.2.5.10 FAERBUNGEN SYPRO RUBY UND PROQ DIAMOND 55
2.2.5.11 WESTERN-BLOT 55
2.2.5.12 IMMUNODETEKTION 55
2.2.5.13 FAERBUNG VON MEMBRANEN MIT DEM PONCEAUS-S-FARBSTOFF 57
2.2.6 ENZYMAKTIVITAETSMESSUNGEN 58
2.2.6.1 KINASEAKTIVITAETSMESSUNGEN 58
2.2.7 INTERAKTIONSSTUDIEN 58
2.2.7.1 SLAC1-CPK23-COIMMUNPRAEZIPITATIONEN 58
2.2.7.2 LERCDPK-ABI2-COIMMUNPRAEZIPITATIONEN 59
2.2.7.3 SURFACE PLASMON RESONANCE - (SPR-) INTERAKTIONSSTUDIEN 60
2.2.7.3.1 IMMOBILISIERUNG DES PEPTIDS 21P1 60
2.2.7.3.2 MESSUNG DES SPR-SIGNALS 60
ERGEBNISSE 61
.1 ANALYSE DER IN VIVO FUNKTION DER CPK21 UND CPK23 61
3.1.1 CHARAKTERISIERUNG DERT-DNA-LNSERTIONSLINIEN DER CPK21 UND CPK23 61
3.1.1.1 BESTIMMUNG DES T-DNA-INSERTIONSORTES FUER DIE T-DNA-LINIE MIT
INSERTIONSEREIGNIS IN CPK21 (SALK_029412) 61
3.1.1.2 BESTIMMUNG DES T-DNA-INSERTIONSORTES FUER DIE T-DNA-LINIE MIT
INSERTIONSEREIGNIS IN CPK23 (SALK_007958) 63
3.1.1.3 UNTERSUCHUNGEN EINES RESTTRANSKRIPTS IN DER CPK23- 7-MUTANTE 64
3.1.2 PHAENOTYPISCHE UNTERSUCHUNG DER CPK21-1 UNTER HYPEROSMOTISCHEN
STRESSBEDINGUNGEN 65
3.1.3 ANALYSE DER ABIOTISCHEN STRESS- UND ABA-ABHAENGIGEN MARKERGENE IN
CPK21-1 UND CPK23-1 67
3.1.4 UNTERSUCHUNG DER FUNKTION DER CPK21 UND CPK23 IN DER ABA-
SIGNALTRANSDUKTION 70
V
IMAGE 4
3.1.4.1 ANALYSE DES EINFLUSSES DER CPK21 UND CPK23 AUF DIE EXPRESSION
VON
RD29B 70
3.1.4.1.1 UNTERSUCHUNG DER RD29SS-EXPRESSION IN CPK21-1- UND CPK23-1
PROTOPLASTEN 71
3.1.4.1.2 UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON CPK23 AUF DIE ABA- UND
RCAR1ABHAENGIGE RD29SS-EXPRESSION 72
3.1.4.1.3 UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES DER CPK21 AUF DIE ABA-UND
RCAR1ABHAENGIGE RD29SS-EXPRESSION.... 73
3.1.4.2 INTERAKTIONS- UND REGULATORISCHE ANALYSE MIT ANDEREN KOMPONENTEN
DER ABA-SIGNALTRANSDUKTION 75
3.1.4.2.1 INTERAKTIONSSTUDIEN EINER CPK23 HOMOLOGEN LERCDPK MIT ABI2 76
3.1.4.2.2 SLOW- (LANGSAME) ANIONENKANAELE ALS IN VIVO INTERAKTOREN DER
CPK21 UND CPK23 77
3.1.4.2.3 INTERAKTIONSANALYSEN DER CPK23 MIT NT-SLAC1 78
3.1.4.2.4 NACHWEIS DER IN VIVO PHOSPHORYLIERUNG VON NT-SLAH3 DURCH CPK21
..79
3.2 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER CPK21 UND CPK23 81
3.2.1 CA 2+ -ABHAENGIGKEIT DER IN VITRO KINASEAKTIVITAET DER CPK23 UND
CPK21 81
3.2.2 CPK23 EINE CA 2+ -ABHAENGIGE KINASE? SEQUENZVERGLEICH DER CPK21 UND
CPK23 82
3.2.2.1 VERGLEICH DER CALMODULINAEHNLICHEN DOMAENE 83
3.2.2.2 VERGLEICH DES PSEUDOSUBSTRATSEGMENTS 84
3.2.3 IN DIESER ARBEIT VERWENDETE CPK21- UND CPK23-CHIMAEREN UND
PUNKTMUTATIONSKONSTRUKTE 87
3.2.4 CA 2+ -ABHAENGIGE KINASEAKTIVITAET-CPK23::21-CLD-CHIMAERE UND
PUNKTMUTANTEN IN DER EF-HAND 1 UND DEM PSEUDOSUBSTRATSEGMENT 88
3.2.5 UNTERSUCHUNG DES CA 2+ -ABHAENGIGEN LAUFVERHALTENS IN DER SDS-
GELELEKTROPHORESE 91
3.2.5.1 ANALYSE DES CA 2+ -ABHAENGIGEN LAUFVERHALTENS IM SDS-GEL EINER
CPK21INAKTIVEN VARIANTE UND DER CPK21-CLD 92
3.2.5.2 UNTERSUCHUNG DES CA 2+ -ABHAENGIGEN LAUFVERHALTENS IM SDS-GEL DER
CPK23:21-CLD-CHIMAERE 93
3.2.6 UNTERSUCHUNG DES (AUTO-) PHOSPHORYLIERUNGSZUSTANDS IN
E.CO// -EXPRIMIERTEN CPK23-VARIANTEN 93
3.2.7 ANALYSE DER CPK23-VARIANTEN MIT DEGENERIERTEN EF-HAND-MOTIVEN 95
3.2.8 CA 2+ -ABHAENGIGE INTRAMOLEKULARE INTERAKTION ZWISCHEN DEM
PSEUDOSUBSTRATSEGMENT UND DER CLD DER CPK21 97
DISKUSSION 100
4.1 AKTIVIERUNG VON CDPKS IN ABHAENGIGKEIT VON CA 2+ 100
4.1.1 IST CPK23 EINE CA 2+ -ABHAENGIGE KINASE? 100
4.1.1.1 DIE CA 2+ -BINDEMOTIVE DER CPK23 100
V I
IMAGE 5
4.1.1.2 DIE EF-HAND 1 ALS CA 2+ -BINDEMOTIV IN DER CPK23 100
4.1.1.3 CPK23-CLD 102
4.1.1.4 FUNKTIONALITAET DER CPK23-EF-HAENDE 103
4.1.2 PSEUDOSUBSTRATSEGMENT 105
4.1.2.1 PSEUDOSUBSTRATSEGMENT DER CPK23 105
4.1.2.2 INTERAKTIONSSTUDIEN ZUM PSEUDOSUBSTRATSEGMENT UND ZUR CLD 106
4.1.3 REGULIERUNG DER CPK23-AKTIVITAET DURCH PHOSPHORYLIERUNG 108
4.1.3.1 REGULIERUNG DER CPK23-AKTIVITAET DURCH PHOSPHORYLIERUNG DES
PSEUDOSUBSTRATSEGMENTS 109
4.2 CPK21 UND CPK23 ALS REGULATOREN DER ABIOTISCHEN STRESS-SIGNAL-
TRANSDUKTION 110
4.2.1 FUNKTIONALITAET EINES RESTTRANSKRIPTS IN DEN LINIEN CPK.21-1 UND
CPK23-1 110
4.2.2 CPK21-1 ZEIGT EINE ERHOEHTE TOLERANZ GEGENUEBER OSMOTISCHEM STRESS
111
4.2.3 CPK21-1 UND CPK23-1 ZEIGEN EINE ERHOEHTE EXPRESSION ABA- UND
ABIOTISCHER STRESS-ABHAENGIGER MARKERGENE 113
4.2.4 CPK21 UND CPK23 IN DER ABA-SIGNALTRANSDUKTION 116
4.2.4.1 CPK21 UND CPK23 ALS NEGATIVE REGULATOREN IN DER ABA- UND
RCAR1ABHAENGIGEN RD29B- EXPRESSION 116
4.2.5 TEILWEISE UEBERSCHNEIDENDE FUNKTIONEN DERCPK21 UND CPK23 118
4.2.6 INTERAKTIONS- UND REGULATORISCHE ANALYSE MIT ANDEREN KOMPONENTEN
DER ABASIGNALTRANSDUKTION 119
4.2.6.1 PP2CS ALS INTERAKTOREN DERCPK21 UND CPK23 119
4.2.6.2 ANIONENKANAELE ALS IN VIVO SUBSTRATE DER CPK21 UND CPK23 120
4.2.6.3 UNTERSCHIEDLICHE FUNKTIONEN DER CPK21 UND CPK23 IN DER
ABASIGNALTRANSDUKTION IN UNTERSCHIEDLICHEN ZELLTYPEN 122
5 ZUSAMMENFASSUNG / SUMMARY 124
5.1 ZUSAMMENFASSUNG 124
5.2 SUMMARY 125
6 QUELLEN 127
7 ANHANG XVII
VII
|
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| spelling | Liese, Anja Katarina Claire 1981- Verfasser (DE-588)1029803226 aut Regulation und Funktion von AtCPK21 und AtCPK23 in der schnellen ABA-Signaltransduktion und adaptiven abiotischen Stressantwort vorgelegt von Anja Katarina Claire Liese Regulation and function of AtCPK21 and AtCPK23 in abiotic stress response and ABA signal transduction 2012 XXXV, 137 Bl. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Nebentitel: Regulation and function of AtCPK21 and AtCPK23 in abiotic stress response and ABA signal transduction Berlin, Freie Univ., Diss., 2012 (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000044492-0 http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000044492 kostenfrei Volltext DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=025503783&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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