Studien zum mRNA profiling an humanem postmortalem Gewebe:
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INHALT
ABKUERZUNGEN 4
1 EINLEITUNG 7
1.1 RIBONUKLEINSAEUREN 7
1.2 REGULATION DER GENEXPRESSION AUF RNA-EBENE 8
1.3 ANALYSE DER GENEXPRESSION IM FORENSISCHEN KONTEXT 10
1.4 STABILITAET VON RIBONUKLEINSAEUREN 12
1.4.1 RNA STABILITAET IN DER ZELLE 13
1.4.2 STABILITAET VON MRNA IN FORENSISCH RELEVANTEM SPURENMATERIAL 14
1.4.3 STABILITAET VON MRNA IN POSTMORTALEM GEWEBE 14
1.5 GENEXPRESSIONSSTUDIEN AN HUMANEM MATERIAL 17
1.5.1 BIOLOGISCHE UND TECHNISCHE REPLIKATE 18
1.5.2 RNA INTEGRITAET 20
1.6 DATENNORMALISIERUNG 23
1.6.1 NORMALISIERUNG GEGEN DIE EINGESETZTE GEWEBEMENGE 24 1.6.2
NORMALISIERUNG GEGEN DEN DNA-GEHALT EINER PROBE 24
1.6.3 NORMALISIERUNG GEGEN DEN RNA-GEHALT EINER PROBE 25
1.6.4 NORMALISIERUNG GEGEN EINE EXTERNE KONTROLLE 25
1.6.5 NORMALISIERUNG GEGEN ENDOGENE KONTROLLGENE 26
1.7 VALIDIERUNG ENDOGENER KONTROLLGENE 29
1.8 DATENAUSWERTUNG UND -INTERPRETATION 30
1.8.1 DATENANALYSE NACH DEM 2 _AACT -ALGORITHMUS 30
1.8.2 SOFTWAREGESTEUERTE DATENANALYSE UNTER EINBEZIEHUNG DER WAHREN
PCREFFIZIENZ 31
1.9 GENEXPRESSION NACH HYPOXIE 33
1.9.1 HYPOXIE 33
1.9.2 HIF-1 A, VEGF UND SLC2A1 34
1.10 ZIELE DER ARBEIT 37
2 MATERIAL UND METHODEN 39
2.1 MATERIAL 39
2.1.1 REAGENZIEN 39
2.1.2 FERTIGE REAKTIONSSYSTEME (KITS) 40
2.1.3 GERAETE 41
2.1.4 VERBRAUCHSMATERIALIEN 42
2.1.5 LOESUNGEN 42
2.1.6 ENZYME 43
2.1.7 GEWEBEPROBEN 43
2.2 METHODEN 44
2.2.1 ANFORDERUNGEN AN DIE ARBEIT MIT RNA 45
2.2.2 RNA-EXTRAKTION MITTELS PHENOL/CHLOROFORM/ISOAMYLALKOHOL 46 2.2.3
ENTFERNEN GENOMISCHER DNA MITTELS DNASE 47
2.2.4 AUFREINIGUNG VON RNA-EXTRAKTEN 48
2.2.5 QUANTIFIZIERUNG DER GESAMT-RNA 49
2.2.6 MESSEN DER RNA-INTEGRITAET 50
2.2.7 REVERSE TRANSKRIPTION 50
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IMAGE 2
2.2.8 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR 51
2.2.9 BERECHNUNG DER EXPRESSIONSSTABILITAET 54
2.2.10 QBASE - ERMITTELN DER EXPRESSIONSUNTERSCHIEDE 57
2.2.11 STATISTISCHE AUSWERTUNG UND DARSTELLUNG 57
3 ERGEBNISSE 58
3.1 RNA-INTEGRITAET AN POSTMORTALEN GEWEBEPROBEN 58
3.1.1 PROBENAUFBEREITUNG UND QUALITAETSKONTROLLE 58
3.1.2 EINFLUSS VERSCHIEDENER PARAMETER AUF DIE RNA-INTEGRITAET 60 3.2
STABILITAET ENDOGENER KONTROLLGENE IN POSTMORTALEN GEWEBEPROBEN 68 3.2.1
PROBENAUFBEREITUNG UND QUALITAETSKONTROLLE 68
3.2.2 STABILITAET DER KONTROLLGENE 72
3.2.3 EINFLUSS VERSCHIEDENER PARAMETER AUF DAS TRANSKRIPTLEVEL
INSTABILER GENE 75
3.3 EINFLUSS DER RNA-INTEGRITAET AUF QUANTITATIVE GENEXPRESSIONSANALYSEN
86 3.3.1 GEZIELTE DEGRADIERUNG KOMMERZIELL BEZOGENER RNA 86 3.3.2
DATENNORMALISIERUNG BEI VERMINDERTER RNA-QUALITAET 92 3.4 EINFLUSS DER
TODESURSACHE AUF DIE EXPRESSION VON HIF-1A, VEGF UND
SLC2A1 94
3.4.1 RNA-EXTRAKTION, RNA-QUALITAETSKONTROLLE UND
TRANSKRIPTQUANTIFIZIERUNG 94 3.4.2 DATENNORMALISIERUNG GEGEN VIER
VALIDIERTE STABILE KONTROLLGENE 106 3.4.3 DATENNORMALISIERUNG GEGEN EIN
EINZELNES KONTROLLGEN 109 3.4.4 TRANSKRIPTSTABILITAET VON GAPDH, HMBS,
UBC, SDHA UND B2M 112
4 DISKUSSION 114
4.1 VOM RNA-EXTRAKT ZUM QUANTIFIZIERTEN GENTRANSKRIPT 114
4.1.1 BEURTEILUNG DER RNA-QUANTITAET UND REINHEIT 114
4.1.2 REVERSE T RANSKRIPTION 116
4.1.3 BEURTEILUNG DER RNA-INTEGRITAET 116
4.1.4 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR 117
4.1.5 RESUEMEE 120
4.2 RNA-INTEGRITAET IN POSTMORTALEN GEWEBEPROBEN 121
4.2.1 EINFLUSS VERSCHIEDENER PARAMETER AUF DIE RNA-INTEGRITAET 121 4.2.2
RESUEMEE DER TEILSTUDIE 132
4.3 TRANSKRIPTSTABILITAET ENDOGENER KONTROLLGENE 133
4.3.1 STABILE KONTROLLGENE IN POSTMORTALEM GEWEBE 134
4.3.2 MINDESTANZAHL ENDOGENER KONTROLLGENE 135
4.3.3 EINFLUSS VERSCHIEDENER PARAMETER AUF DAS TRANSKRIPTLEVEL
INSTABILER GENE 138
4.3.4 RESUEMEE DER TEILSTUDIE 144
4.4 EINFLUSS DER RNA-INTEGRITAET AUF DAS ERGEBNIS DER QUANTITATIVEN
ANALYSE.. 145 4.4.1 RIN UND C Q -VERSCHIEBUNG IN RNA-DEGRADIERUNGSLINIEN
145 4.4.2 EINFLUSS DER DATENNORMALISIERUNG AUF DEN ZUSAMMENHANG ZWISCHEN
INTEGRITAET UND QUANTITATIVEN GENEXPRESSIONSDATEN 148
4.4.3 RESUEMEE DER TEILSTUDIE 151
4.5 EINFLUSS DER NORMALISIERUNGSSTRATEGIE AM BEISPIEL DER EXPRESSION VON
HIF-1A1, VEGF UND SLC2A1 152
4.5.1 VIER VERSUS EINS: DIE FOLGEN DER GEWAEHLTEN
NORMALISIERUNGSSTRATEGIE 155 4.5.1 RESUEMEE DER TEILSTUDIE 161
2
IMAGE 3
5 ZUSAMMENFASSUNG 163
6 SUMMARY 165
7 VERZEICHNIS DER WISSENSCHAFTLICHEN VEROEFFENTLICHUNGEN 167
8 ANHANG 168
8.1 DATENERHEBUNGSBOGEN 168
8.2 INDIVIDUEN UEBERSICHT 169
8.3 ERGEBNISSE AUS EINER VORSTUDIE 173
8.4 ERGEBNISSE VON ZUSAETZLICHEN PROBEN FUER DIE RIN-STUDIE 175 8.5 PMI
VERSUS RNA-QUANTITAET 176
8.6 LITERATUR 179
9 DANKSAGUNG 199
10 ERKLAERUNG 201
3
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