Labormedizinisches Monitoring herztransplantierter Patienten unter Everolimus-Therapie:
Gespeichert in:
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG V I
INHALTSVERZEICHNIS V I I I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS X I I I
1 EINLEITUNG 1
1.1 HERZTRANSPLANTATION-DEFINITION UND GESCHICHTE 1
1.2 GESCHICHTE DER HERZTRANSPLANTATION 1
1.3 ARZNEITHERAPEUTISCHE BETREUUNG IN DER PHASE NACH TRANSPLANTATION 2
1.3.1 IMMUNOLOGISCHE FORM DER ABSTOSSUNG 2
1.3.2 VASKULAERE ABSTOSSUNGSFORMEN-CHRONISCHE TRANSPLANTATVASKULOPATHIE- 4
1.4 IMMUNSUPPRESSIVE THERAPIE 5
1.4.1 KORTIKOSTEROIDE 5
1.4.2 MYCOPHENOLAT-MOFETIL (MMF) 6
1.4.3 AZATHIOPRIN 6
1.4.4 CALCINEURININHIBITOREN 9
1.4.4.1 CYCLOSPORIN A 9
1.4.4.2 TACROLIMUS 10
1.4.5 M-TOR-ANTAGONISTEN 11
1.4.5.1 SIROLIMUS 11
1.4.5.2 EVEROLIMUS 13
1.5 IMMUNSUPPRESSION: ERWARTUNGEN UND AUSBLICK 14
1.6 ARTERIOSKLEROSE-PATHOLOGIE UND ENTSTEHUNGSMECHANISMUS 14
1.6.1 ARTERIOSKLEROSE IM TRANSPLANTIERTEN HERZEN 17
1.7 KLASSISCHE BIOMARKER UND PRAEDIKTION DER ARTERIOSKLEROSE 20
1.8 HYPERLIPIDAEMIE IN DER HERZTRANSPLANTATION 21
1.9 ENTZUENDLICHE PARAMETER IN DER ARTERIOSKLEROSE 22
1.9.1 LIPOPROTEIN ASSOZIIERTE PHOSPHOLIPASE A2 22
1.9.2 MYELOPEROXIDASE 24
1.9.3 LOESLICHER CD40 LIGAND 24
VIII
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IMAGE 2
1.10 MARKER DER ENTZUENDLICHEN PROZESSE DER ARTERIOSKLEROSE BEI
TRANSPLANTATVASKULOPATHIE 25
1.11 BEDEUTUNG DER LABORMEDIZINISCHEN UEBERWACHUNG IN DER NACHSORGE DER
HERZTRANSPLANTATION 27
1.11.1 BIOMARKER DER HERZMUSKELFUNKTION UND -SCHAEDIGUNG 27
1.11.1.1 N-TERMINALES PRO TYP B NATRIURETISCHES PEPTID 27
1.11.1.2 KARDIALES TROPONIN I 27
1.11.2 NIERENFUNKTIONSPARAMETER 28
1.11.2.1 ALBUMIN 28
1.11.2.2 A-1-MIKROGLOBULIN 29
1.11.2.3 NEUTROPHILEN GELATINASE ASSOZIIERTES LIPOCALIN 29
1.12 THERAPEUTISCHES DRUG MONITORING 31
1.12.1 LABORMEDIZINISCHE ANALYSE DES IMMUNSUPPRESSIVUMS EVEROLIMUS 31
1.12.2 LABORMEDIZINISCHE ANALYSE PER HOCHLEISTUNGSFLUESSIGCHROMATOGRAPHIE
MITTELS GEKOPPELTER MASSENSPEKTROMETRIE 32
1.13 ZIELE DER ARBEIT 35
2 MATERIAL UND METHODEN 3 6
2.1 ZUSAMMENSTELLUNG DES PATIENTEN-KOLLEKTIVS UND ERSTELLUNG DER
PROBENDATENBANK 36
2.1.1 KONSERVIERUNG DER PROBEN 37
2.2 ZELLKULTUR 37
2.2.1 KULTIVIERUNG DER HEP G2 ZELLLINIE 37
2.2.2 KRYOKONSERVIERUNG DER LEBERKARZINOMZELLLINIE 38
2.2.3 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION NACH PIERCE 38
2.2.4 HERSTELLUNG DER ZELLLYSATE FUER DIE ANALYSE PER WESTERN BLOT 39
, /
2.3 PROTEINBIOCHEMIE 39
2.3.1 SODIUMDODECYLSULFAT-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 39
2.3.2 WESTERN BLOT 41
2.3.3 ENZYME LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY (ELISA) 42
2.3.4 BESTIMMUNG VON ENZYMAKTIVITAET UND -MASSE DER LP-PLA2 AUS HUMANEM
PLASMA 44
IX
IMAGE 3
2.3.4.1 BESTIMMUNG DER MYELOPEROXIDASE PER IMMUNOASSAY 45
2.3.4.2 IMMUNOASSAY ZUR QUANTITATIVEN BESTIMMUNG DES LOESLICHEN CD 40
LIGANDEN 45
2.3.4.3 BESTIMMUNG DES NEUTROPHILEN GELATINASE ASSOZIIERTEN LIPOCALINS
46
2.3.5 TROPONIN I, HOCHSENSITIVES C-REAKTIVES PROTEIN UND KREATININ AUS
PATIENTENPROBEN 46
2.4 BESTIMMUNG DER ENZYMAKTIVITAET UND -MENGE AUS ZELLUEBERSTAENDEN EINER
LEBERKARZINOMZELLLINIE 47
2.4.1 FUER DIE ZELLKULTUR NOTWENDIGE MATERIALIEN 48
2.4.2 ANTIKOERPER UND CHEMIKALIEN 51
2.5 BESCHREIBUNG EINES VERFAHRENS ZUR QUANTITATIVEN ANALYSE DES
IMMUNSUPPRESSIVUMS EVEROLIMUS MITTELS HPLC-GEKOPPELTER
MASSENSPEKTROMETRIE. 53
2.5.1 DAS MESSPRINZIP DER
HOCHLEISTUNGSFLUESSIGCHROMATOGRAPHIE/MASSENSPEKTROMETRIE-KOPPLUNG
(LC-MS) 53
2.5.1.1 PROBENVORBEREITUNG 53
2.5.2 QUANTITATIVE ERFASSUNG VON EVEROLIMUS MITTELS
HOCHLEISTUNGSFLUESSIGCHROMATOGRAPHIE MIT EINEM SINGLE-QUAD-DETEKTOR
(LC-MS) 54
2.5.2.1 AUSSTATTUNG UND LC-MS-GERAETEPARAMETER 54
2.5.2.2 TRENNBEDINGUNGEN DER LC-MS 55
2.5.2.3 VERFAHREN DER BESTIMMUNG VON EVEROLIMUS MITTELS
TANDEMMASSENSPEKTROMETRIE (LC-MS/MS) 56
2.5.2.4 AUSSTATTUNG DES LC-MS/MS-SYSTEMS 56
2.5.3 PROBENAUFARBEITUNG LC-MS/MS 59
3 ERGEBNISSE 6 0
3.1 ENTWICKLUNG EINER VERFAHRENS ZUR BESTIMMUNG DES IMMUNSUPPRESSIVUMS
EVEROLIMUS AUS VOLLBLUT PER HOCHLEISTUNGSFLUESSIGCHROMATOGRAPHIE MIT
GEKOPPELTER MASSENSPEKTROMETRIE 60
3.2 METHODENENTWICKLUNG 60
3.2.1 PROBENVORBEREITUNG 60
3.2.2 FESTPHASEN-EXTRAKTION 61
X
IMAGE 4
3.2.3 AUSWAHL DES INTERNEN STANDARDS 63
3.2.4 ISOKRATISCHES VERFAHREN 63
3.2.5 MATRIXEFFEKTE 64
3.2.6 LINEARITAET 64
3.2.7 PRAEZISION UND RICHTIGKEIT 66
3.2.8 NACHWEIS UND BESTIMMUNGSGRENZE 69
3.2.9 WIEDERFINDUNG 69
3.2.10 LANGZEITSTABILITAET DER PROBEN 70
3.2.11 METHODENVERGLEICH NACH PASSING-BABLOK 72
3.3 ETABLIERUNG EINER METHODE ZUR QUANTITATIVEN BESTIMMUNG VON
EVEROLIMUS UND
DEN IMMUNSUPPRESSIVA SIROLIMUS, CSA UND TACROLIMUS PER
HOCHLEISTUNGSFLUESSIGCHROMATOGRAPHIE MIT GEKOPPELTER
TANDEMMASSENSPEKTROMETRIE 73
3.3.1 LINEARITAET 74
3.3.2 PRAEZISION UND RICHTIGKEIT 75
3.3.3 NACHWEIS- UND BESTIMMUNGSGRENZE 75
3.3.4 WIEDERFINDUNG 76
3.3.5 LANGZEITSTABILITAET DER PROBEN 77
3.3.5.1 METHODENVERGLEICH MIT HPLC-MS 78
3.3.6 AUSBLICK: SIMULTANE MESSUNG DER IMMUNSUPPRESSIVA EVEROLIMUS,
TACROLIMUS, SIROLIMUS UND CYCLOSPORIN A 79
3.4 ERSTELLUNG EINER PROBENDATENBANK ZUR ERHEBUNG VON PARAMETERN DER
HERZ- UND
NIERENFUNKTION 80
3.5 PATIENTENAUSWAHL UND GRUPPENZUSAMMENSTELLUNG 80
3.6 VERGLEICH DER KARDIOVASKULAEREN RISIKOFAKTOREN ZWISCHEN DEN
BEHANDLUNGSGRUPPEN 82
3.6.1 KLASSISCHE RISIKOFAKTOREN DER ARTERIOSKLEROSE 82
3.6.2 METABOLISCHE RISIKOFAKTOREN DER ARTERIOSKLEROSE 84
3.6.3 INFLAMMATORISCHE RISIKOFAKTOREN DER ARTERIOSKLEROSE 85
3.6.4 VERGLEICH DER NIERENFUNKTIONSPARAMETER BEI DEN BEHANDLUNGSGRUPPEN
87
3.7 BESTIMMUNG DER KARDIOVASKULAEREN FAKTOREN 90
XI
IMAGE 5
3.8 KORRELATIONEN ZWISCHEN DEN KARDIOVASKULAEREN RISIKOFAKTOREN 91
3.8.1 KLASSISCHE RISIKOFAKTOREN 91
3.8.2 METABOLISCHE RISIKOFAKTOREN 91
3.8.3 INFLAMMATORISCHE RISIKOFAKTOREN 91
3.8.4 NIERENFUNKTIONSPARAMETER 92
3.8.5 KARDIALE BIOMARKER 92
3.8.6 KORRELATION VON LP-PLA2 UND DER EVEROLIMUS-KONZENTRATION IM
VOLLBLUT 93
3.9 UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON EVEROLIMUS AUF DIE AKTIVITAET DER
LP-PLA2 IN
HUMANEM PLASMA UND AUF DIE ZELLULAERE PRODUKTION 96
3.9.1 BESTIMMUNG DER ENZYMMENGE AUS DEN UEBERSTAENDEN DER ZELLKULTURLINIE
HEP G2 97
3.10 BEURTEILUNG DER KLINISCHEN ERGEBNISSE 100
4 DISKUSSION 1 0 4
4.1 ENTWICKLUNG EINES ANALYTISCHEN VERFAHRENS ZUR BESTIMMUNG VON
EVEROLIMUS AUS
DEM VOLLBLUT 104
4.2 BIOMARKER ZUR VORHERSAGE DER THERAPIEEFFEKTIVITAET IN DER
HERZTRANSPLANTATION 107
LITERATURVERZEICHNIS 1 1 4
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 1 3 1
TABELLENVERZEICHNIS 1 3 4
DANKSAGUNG 1 3 5
LEBENSLAUF 1 3 7
XII
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