Effekte von Elicitin auf Wachstum, Proliferation und Signaltransduktion von Tumorzellen in vitro:
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2012
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1. EINLEITUNG 8
1.1 KREBS: EPIDEMIOLOGIE, ENTSTEHUNG UND BEKAEMPFUNG 8
1.2 ZYTOTOXISCHE EIGENSCHAFTEN VERSCHIEDENER PHYTOPHTHORA-PATHOGENE 1 1
1.3 ELICITINE, SPEZIFISCHE PEPTIDE DER PHYTOPHTHORA 12
1.3.1 WIRKUNG VON ELICITINEN 13
1.3.2 SPEZIFISCHE REZEPTOREN UND MAP-KINASE-KASKADE 14
1.3.3 ELICITIN INDUZIERTE SIGNALTRANSDUKTION 15
1.3.3.1 LONENFLUSS UEBER MEMBRANEN 15
1.3.3.2 OXIDATIVE BURST ( 0 2 H 2 0 2 ) UND ZELLTOD 15
1.3.4 WEITERE ELICITINWIRKUNGEN 16
1.3.4.1 STEROLTRANSPORT 16
1.3.4.2 MIKROTUBULIZERSTOERUNG 17
1.4 ELICITINE ALS MOEGLICHE ANTITUMORPEPTIDE 17
1.4.1 ALLGEMEINES 17
1.4.2 ROS 17
1.4.3 MIKROTUBULIDESTRUKTION 19
1.4.4 VERGLEICHBARE SIGNALKASKADEN (MAP-KINASEN; BILDUNG VON ROS) 19
1.4.4 SPEZIFISCHE FRAGESTELLUNG 22
2.1 GEWINNUNG UND ISOLATION DER ELICITINE 23
2.1.1 ELICITINE AUS EINEM AKTIVEN P. QUERCINA UND P. CITRICOLA ISOLAT 23
2.1.2 ELICITINE AUS EINEM FUER ZWEI JAHRE IN DER MYKOTHEK GELAGERTEN P.
QUERCINA ISOLAT 23
2.1.2.1 GEMEINSAME AUFREINIGUNG DER SAUREN UND BASISCHEN ELICITINE AUS
DEM KULTURFILTRAT VON
PHYTOPHTHORA QUERCINA 23
2.1.2.2 AUFREINIGUNG VON P. QUERCINA ELICITINEN BEI VERSCHIEDENEN
PH-WERTEN 24
2.1.2.3 AUFREINIGUNG DER BASISCHEN ELICITINE AUS DEM KULTURFILTRAT VON
P. QUERCINA 25
2.1.3 AKTIVITAETSTEST DER GEREINIGTEN ELICITINFRAKTIONEN 25
2.2 PROTEINQUANTIFIZIERUNG MIT BCA 26
2.3 ZELLKULTUR 28
4
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IMAGE 2
2.4 WACHSTUMSKURVE 29
2.4.1 VERDUENNUNGSREIHE 30
2.4.2 ERNTEN 30
/
2.5 MTT-ASSAY 3 1
2.6 H 202-ASSAY 33
2.7 WESTERN BLOT 34
2.8 FACS-ANALYSE 40
2.8.1 CFSE-FAERBUNG 40
2.8.2 7AAD-APOPTOSE-ASSAY 43
2.9 DATENANALYSE 43
2.10 VERWENDETE SOFTWARE: 44
3. ERGEBNISSE 45
3.1 VORVERSUCHE ZUR ETABLIERUNG DER MTT-METHODE (EXPERIMENT 1) 45
3.2 VERSUCHE MIT ELICITINEN AUS EINEM AKTIVEN P. QUERCINA UND P.
CITRICOLA ISOLAT 47
3.2.1 B-16 ZELLEN, EXPERIMENT 2A 47
3.2.2. CT-26 ZELLEN, EXPERIMENT 2B UND 2B 49
3.2.3 TMK-1, EXPERIMENT 2C 51
3.2.4 KREUZTESTUNG MIT PBS, EXPERIMENT 3A 51
3.2.5 HUVECS, EXPERIMENT 3B 52
3.2.6 KERATINOZYTEN, EXPERIMENT 3C 53
3.2.7 ZUSAMMENFASSUNG DER SCREENINGEXPERIMENTE 54
3.3 VERSUCHE MIT ELICITINEN AUS EINEM FUER ZWEI JAHRE GELAGERTEN P.
QUERCINA ISOLAT 55
3.3.1 VERSUCHE MIT ELICITINMISCHISOLAT (SAURE UND BASISCHE ELICITINE)
AUS EINEM PHYTOPHTORA QUERCINA
KULTURFILTRAT 55
3.3.1.1 TMK-1, EXPERIMENT 4 55
3.3.1.2 KERATINOZYTEN, EXPERIMENT 5 57
3.3.1.3 CT-26, EXPERIMENTE 6 + 7 59
3.3.1.4 LLC-1, EXPERIMENT 8 63
5
IMAGE 3
3.3.1.5 RUECKKEHR ZU B-16 65
3.3.1.5.1 ZELLKULTUR, EXPERIMENT 9 65
3.3.1.5.2 KREUZTESTUNG DER BCA REAGENZIEN 68
3.3.1.5.3 H 2 0 2 -MESSUNG, EXPERIMENT 10 69
3.3.1.5.4 WESTERNBLOTS, EXPERIMENT 11 70
3.3.1.5.5 DIAETEXPERIMENTE 72
3.3.1.5.5.1 DIAETSTRESS VOR ELICITINGABE, EXPERIMENT 12A 72
3.3.1.5.5.2 DIAETSTRESS BEI GLEICHZEITIGER ELICITINGABE, EXPERIMENT 12B
73
3.3.1.5.5.3 DIAETEXPERIMENT MIT AUFSTEIGENDEN FCS KONZENTRATIONEN IM
MEDIUM, EXPERIMENT 13
(ENTSPRICHT EL 19) 73
3.3.1.5.6 FACS-ANALYSE, EXPERIMENT 14 (ENTSPRICHT EL 20) 75
3.3.1.5.6.1 CFSE, EXPERIMENT 14A 77
3.3.1.5.6.2 7AAD, EXPERIMENT 14B 77
3.3.2 VERSUCHE MIT HAUPTSAECHLICH BASISCHEN ELICITINEN AUS EINEM
PHYTOPHTORA QUERCINA KULTURFILTRAT UNTER
VERWENDUNG VERSCHIEDENER AUFREINIGUNGSARTEN UND KULTURBEDINGUNGEN 79
3.3.2.1 VERSUCHE MIT UNTERSCHIEDLICHEM AUFREINIGUNGSGRAD (A BZW. A + K)
UND OBERFLAECHEN, EXPERIMENT
15 79
3.3.2.2 VERSUCHE MIT BEI UNTERSCHIEDLICHEN PH-WERTEN ISOLIERTEN
ELICITINEN: 81
3.3.2.2.1 EXPERIMENT OHNE MEDIUMWECHSEL, EXPERIMENT 16 82
3.3.2.2.2 EXPERIMENT MIT MEDIUMWECHSEL UND HOHER ZELLDICHTE, EXPERIMENT
17 83
3.3.2.2.3 EXPERIMENT MIT NIEDRIGEN QUERCININKONZENTRATIONEN, EXPERIMENT
18 84
3.3.2.3 VERSUCHE MIT UNTERSCHIEDLICHER ZELLDICHTE (DURCH HOEHERE
ZELLDICHTE BEI AUSSAAT ODER VERLAENGERTE
EINWIRKUNGSZEIT) 85
3.3.2.3.1 EXPERIMENT 19 86
3.3.2.3.2 EXPERIMENT 20 87
3.3.2.3.3 EXPERIMENT 21 87
3.3.2.3.4 EXPERIMENT 22 88
3.3.2.4 EINFLUSS AUF ADHAESIONSVERHALTEN, EXPERIMENT 23 89
3.3.2.5 EINFLUSS DER LYOPHILISATION AUF ELICITINAKTIVITAET, EXPERIMENTE
24 UND 24 90
4. DISKUSSION 95
6
IMAGE 4
4.1 ALLGEMEINER TEIL 95
4.2. DISKUSSION DER METHODEN 95
4.3 DISKUSSION DER EINZELNEN ZELLLINIENR. 97
4.3.1 B16 97
4.3.2 CT-26 101
4.3.3 LLC-1 103
4.3.4 TMK-1 103
4.3.5 HUVECS 104
4.3.6 HEK 104
4.4 ZUSAMMENFASSENDER VERGLEICH DER 4 TUMORZELLLINIEN B-16, CT-26, TMK-1
UND LLC-1 MITEINANDER 105
4.4.1 ZELLZAHL 105
4.4.2 MTT 105
4.4.3 MTT/EINZELZELLE 106
4.5 FAZIT UND AUSBLICK 107
5. ZUSAMMENFASSUNG 1 1 1
6. LEBENSLAUF 113
7. DANKSAGUNG 115
8. MATERIALIEN 116
8.1 SUBSTANZEN UND ZELLKULTURBEDARF 116
8.2 GERAETE 120
9. LITERATURVERZEICHNIS 122
10. ABBILDUNGS-VERZEICHNIS 130
11. TABELLEN-VERZEICHNIS 136
12. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 136
7
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