Struktur-, Dynamik- und Interaktionsstudien an Domänen des bakteriellen Photorezeptors YtvA aus Bacillus subtilis:
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2012
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INHALT
INHALT
1 EINLEITUNG 16
1.1 PHOTOREZEPTOREN - KLASSEN, EIGENSCHAFTEN & FUNKTIONEN 16
1.2 PHOTOREZEPTOREN - MECHANISMEN & UNTERSUCHUNGSMETHODEN 20
1.3 PHOTO TROPINE 24
1.3.1 PHOTOTROPINE - MECHANISMEN DER INTRAMOLEKULAREN SIGNALTRANSDUKTION
25
1.4 LICHTDETEKTION DURCH LOV-DOMAENEN - STRUKTUR UND FUNKTION 32
1.4.1 STRUKTURMERKMALE VON LOV-DOMAENEN 33
1.4.2 PHOTOCHEMIE VON LOV-DOMAENEN 36
1.5 DER BLAULICHT-SENSITIVE PHOTOREZEPTOR YTVA AUS BACILLUS SUBTILIS 39
1.5.1 YTVA - STRUKTURELLE CHARAKTERISTIKA 41
1.5.2 YTVA - INTRAMOLEKULARE SIGNALTRANSDUKTION 44
2 ZIELSTELLUNG 46
3 MATERIAL & METHODEN 48
3.1.1 CHEMIKALIEN 48
3.1.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE UND BIOCHEMISCHE KITS 49
3.1.3 NAEHRMEDIEN UND LOESUNGEN 49
3.1.4 GERAETE, MESSINSTRUMENTE UND TECHNISCHE SYSTEME 50
3.1.5 BAKTERIENSTAEMME 51
3.1.6 KLONIERUNGSVEKTOR 51
3.1.7 OLIGONUKLEOTIDE 52
3.1.8 SOFTWARE 52
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 54
3.2.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 54
3.2.2 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 54
3.2.3 KLONIERUNG 55
3.2.4 RESTRIKTIONSVERDAU 55
3.2.5 ISOLIERUNG VON PLASMIDEN AUS E. COLI 56
3.3 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 56
3.3.1 TRANSFORMATION VON E. COLI 56
3.3.2 HERSTELLUNG VON GLYCEROL-DAUERKULTUREN 56
3.3.3 EXPRESSIONSTEST UND KLONSELEKTION 56
3.3.4 OPTIMIERUNG DER EXPRESSIONSBEDINGUNGEN 57
3.3.5 EXPRESSION IN SCHUETTELKULTUR 57
3.3.6 HOCHZELLDICHTEFERMENTATION (HZDF) 57
3.3.7 KULTIVIERUNG VON BACILLUS SUBTILIS 60
3.3.8 ZELLERNTE 60
8
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IMAGE 2
INHALT
3.3.9 ZELLAUFSCHLUSS UND SEPARATION LOESLICHER PROTEINE 60
3.4 BIOCHEMISCHE METHODEN 61
3.4.1 NATRIUMDODECYLSULFAT-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 61
3.4.2 PROBENHERSTELLUNG FUER SDS-PAGE 61
3.4.3 AUFREINIGUNG REKOMBINANT EXPRIMIERTER PROTEINE 61
3.4.4 HERSTELLUNG VON UNIFORM 1: N-MARKIERTEM APOPROTEIN 63
3.4.5 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION MITTELS BCA-METHODE 64
3.4.6 ANALYSE DER CHROMOPHORSPEZIES IN REKOMBINANT EXPRIMIERTER
LOV-DOMAENE 65
3.4.7 ANALYSE VON FLAVIN-DERIVATEN AUS BACILLUS SUBTILIS 65
3.4.8 REINIGUNG VON KOMMERZIELLEM FMN 66
3.4.9 AUFBEREITUNG FLAVIN-REKONSTITUIERTER PROBEN AUS ITC-EXPERIMENTEN
66
3.5 BIOPHYSIKALISCHE METHODEN 66
3.5.1 PHOTOMETRISCHE MESSUNG VON PROTEINKONZENTRATIONEN 66
3.5.2 PHOTOCHEMISCHE AKTIVITAET UND MESSUNG VON HALBWERTSZEITEN 67
3.5.3 CIRCULAR DICHROISMUS SPEKTROSKOPIE (CD-SPEKTROSKOPIE) 68
3.5.4 ANALYTISCHE ULTRAZENTRIFUGATION (AUZ) 68
3.5.5 ISOTHERME TITRATIONSKALORIMETRIE (ITC) 69
3.5.6 KLEINWINKEL-ROENTGENSTREUUNG (SAXS) 70
3.5.7 LOESUNGS-NMR-SPEKTROSKOPIE 72
4 ERGEBNISSE 76
4.1 KONSTRUKTION LED-BASIERTER LICHTQUELLEN ZUR UNTERSUCHUNG
UNBELICHTETER & PHOTOAKTIVIERTER YTVA-KONSTRUKTE 76
4.1.1 HOCHLEISTUNGS-RGB-LED-LICHTQUELLE 76
4.1.2 AUZ-LED-LICHTQUELLE 77
4.1.3 FASERGEKOPPELTE LED-LICHTQUELLE 78
4.2 EXPRESSION UND PRAEPARATION VON YTVA-KONSTRUKTEN 82
4.2.1 EXPRESSIONSBEDINGUNGEN 82
4.2.2 PRAEPARATION VON JA-STAS UND STAS 82
4.2.3 PRAEPARATION VON YTVA-LOV-VARIANTEN 85
4.2.4 MARKIERUNGSMUSTER UND AUSBEUTEN PRAEPARIERTER YTVA-KONSTRUKTE 87
4.3 STRUKTURELLE CHARAKTERISIERUNG DER STAS-DOMAENE 88
4.3.1 NMR-SPEKTROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN 88
4.3.2 OLIGOMERISIERUNGSZUSTAND 90
4.4 UNTERSUCHUNG DER INTERAKTION VON GTP MIT YTVA BZW. DER STAS-DOMAENE
92
4.4.1 FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE 93
4.4.2 ISOTHERMALE TITRATIONSKALORIMETRIE 94
4.4.3 LOESUNGS-NMR-SPEKTROSKOPIE 97
4.5 CHARAKTERISIERUNG VERSCHIEDENER YTVA-LOV-VARIANTEN 104
9
IMAGE 3
INHALT
4.5.1 PHOTOCHEMISCHE AKTIVITAET 104
4.5.2 CD-SPEKTROSKOPISCHE SEKUNDAERSTRUKTURANALYSE DER JA-SEQUENZ 106
4.5.3 OLIGOMERISIERUNGSZUSTAND 108
4.5.4 NMR-SPEKTROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN 110
4.5.5 UNTERSUCHUNG LICHTINDUZIERTER STRUKTURAENDERUNGEN IN NCAP-LOV-JA
MIT KLEINWINKEL-ROENTGENSTREUUNG 124
4.5.6 STRUKTURMODELL VON UNBELICHTETEM NCAP-LOV-JA 126
4.6 FLAVINBINDUNGSSTUDIEN 129
4.6.1 THERMODYNAMIK DER FLAVIN-APOPROTEIN-WECHSELWIRKUNG 129
4.6.2 CHARAKTERISIERUNG VON DEFLAVINIERTEM & REKONSTITUIERTEM NCAP-LOV
131
4.6.3 DEFLAVINIERTES NCAP-LOV ALS MOLEKULARE SONDE ZUM FLAVIN-NACHWEIS
.... 136
5 DISKUSSION 138
5.1 WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN YTVA & GTP 138
5.2 ABGRENZUNG, FUNKTION & INTRAMOLEKULARE ORGANISATION DISTINKTER
STRUKTUREINHEITEN VON YTVA 142
5.3 PRINZIP DER LICHTGETRIEBENEN MOLEKULAREN SCHALTFUNKTION VON YTVA 147
6 ZUSAMMENFASSUNG 149
7 SUMMARY 151
8 LITERATUR 153
9 VEROEFFENTLICHUNGEN 163
10 EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG 164
11 ANHANG 165
10
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