Interaktion zwischen Metabolismus und Virulenz pathogener Bakterien: 13C-Isotopologstudien und Metabolitprofiling zur Aufklärung von Stoffwechselwegen in pathogenen Bakterien, deren Adaptation an und Beeinflussung von Wirtszellmetabolismen
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
München
Verl. Dr. Hut
2012
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
| Schriftenreihe: | Biochemie
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INHALTSVERZEICHNIS
IX
INHALTSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG 1
1. ISOTOPOLOG-PROFILING 1
1.1. WERKZEUGE DES ISOTOPOLOG-PROFILINGS: NMR- UND GC/MS-ANALYTIK 2
VERNETZUNG VON GC/MS UND NMR-DATEN: 4
2. REKONSTRUKTION VON STOFFWECHSELFLFLSSEN IN DER RETROSPEKTIVE 5
3. ZENTRALE STOFFWECHSELWEGE 9
3.1. KOHLENHYDRATSTOFFWECHSEL 9
3.1.1. ABBAU VON GLUCOSE 9
ENTNER-DOUDOROFF-WEG (ED): 10
3.1.2. GLUCONEOGENESE 12
3.2. CITRATZYKLUS (TCA-ZYKLUS) UND ANAPLEROTISCHE REAKTIONEN 12
3.3. AMINOSAEUREMETABOLISMUS 15
3.4. FETTSAEURESTOFLWECHSEL 20
3.5. (XVFIXIERUNG UND FREISETZUNG 21
4. PROFESSIONELL-FAKULTATIV INTRAZELLULAERE ERREGER 23
5. MODELLORGANISMUS DER FAKULTATIV EXTRAZELLULAEREN INFEKTION:
YERSINIA ENTEROCOLITICA 25
5.1. VIRULENZFAKTOREN VON YERSINIA 26
5.1.1. DAS VIRULENZPLASMID PYV (SSLASMID FOR YERSINIA VIRULENCE) 26
5.1.2. YOPS: YERSINIA OUTER PROTEINS ZUR NEUPROGRAMMIERUNG DER
WIRTSZELLE 27
5.2. DAS TYP-III-SEKRETIONSSYSTEM (T3SS) VON YERSINIEN UND DESSEN
REGULATION 27
6. MODELLORGANISMEN DER INTRAZELLULAER-INVASIVEN INFEKTION: 29
6.1. LEGIONELLA PNEUMOPHILA - EIN PHAGOSOMALER ERREGER 29
6.1.1. EPIDEMIOLOGIE VON L. PNEUMOPHILA - LEGIONELLOSE 30
6.1.2. DER BIPHASISCHE LEBENSZYKLUS VON LEGIONELLA PNEUMOPHILA 30
6.1.3. SEKRETIONSSYSTEME UND VIRULENZFAKTOREN VON L. PNEUMOPHILA 35
6.1.4. ZENTRALE STOFFWECHSELPROZESSE IN L. PNEUMOPHILA - STATE O F THE
ART 36
6.1.5. ACANTHAMOEBA CASTELLANII - DER NATUERLICHE WIRTSORGANISMUS VON
L. PNEUMOPHILA 41
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IMAGE 2
X
INHALTSVERZEICHNIS
6.2. LEGIONELLA OAKRIDGENSIS 43
6.3. LISTERIA MONOCYTOGENES - EIN CYTOSOLISCHER ERREGER 44
7. INFEKTIONSMODELLE IM DIREKTEN VERGLEICH: PRIMAERE VERSUS ETABLIERTE
MAKROPHAGEN 49
8. METABOLOMICS UND METABOLIT-PROFILING..................... 55
9. ZIELSETZUNG 57
IL MATERIAL UND METHODEN 59
1. MATERIALIEN 59
1.1. GERAETE 59
1.2. CHEMIKALIEN 60
1.3. MARKIERTE VERBINDUNGEN 60
1.4. VERWENDETE SOFTWARE 60
2. YERSINIA ENLEROCOLITICA...... 61
2.1. VERWENDETE YERSINIA ENTEROCOLITICA STAEMME 61
2.2. VERWENDETE KULTURMEDIEN 61
2.3. ANZUCHT UND MARKIERUNGSEXPERIMENTE MIT Y. ENTEROCOLITICA 63
3. ACANTHAMOEBA CASTELLANII.... 65
3.1. VERWENDETE AMOEBENKULTUR 65
3.2. VERWENDETE KULTURMEDIEN 65
3.3. ANZUCHT UND MARKIERUNG VON A. CASTELLANII 66
IN VITRO 13C-MARKIERUNG VON A. CASTELLANII (VORMARKIERT) 66
4. LEGIONELLA PNEUMOPHILA PARIS 67
4.1. VERWENDETE STAEMME VON L. PNEUMOPHILA PARIS 67
4.2. VERWENDETE KULTURMEDIEN 68
4.2.1. VERWENDETE KULTURMEDIEN IN VITRO 68
4.2.2. VERWENDETE KULTURMEDIEN IN VIVO 69
4.3. METABOLOMICS-EXPERIMENTE VON L. PNEUMOPHILA IN VITRO 70
4.4. MARKIERUNGSEXPERIMENTE VON L. PNEUMOPHILA IN VITRO 70
4.5. MARKIERUNGSEXPERIMENTE VON L. PNEUMOPHILA IN VIVO IN A. CASTELLANII
71
5. LEGIONELLA OAKRIDGENSIS 73
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS XI
6. J774A.1 MAKROPHAGEN 75
6.1. VERWENDETE J774A. 1 MAKROPHAGEN 75
6.2. VERWENDETE KULTURMEDIEN UND PUFFER 75
6.3. ANZUCHT VON J774A. 1 76
6.4. MARKIERUNGSEXPERIMENTE MIT UNINFIZIERTEN J774A. 1 77
7. PRIMAERE MAUSMAKROPHAGEN 79
8. LISTERIA MONOCYTOGENES 79
9. NMR-MESSUNGEN 81
9.1. 13C-NMR: PROBENVORBEREITUNG 81
9.1.1. ROHEXTRAKTE 81
9.1.2. AMINOSAEUREN 82
9.2. 13C-NMR-SPEKTROSKOPIE 82
9.2.1. ERMITTLUNG DER RELATIVEN 13C-ANREICHERUNG (%13CRCI) 83
9.2.2. BERECHNUNG DER ABSOLUTEN 13C-ANREICHERUNG 83
SCHNITTSTELLE ZWISCHEN H-NMR UND GC/MS: 83
9.2.3. QUANTITATIVE POSITIONEILE % 13C-BESTIMMUNG UEBER 13C13C-KOPPLUNG
85
9.3. METABOLOMICS- H-NMR 86
9.3.1. PROBENVORBEREITUNG - ZELLAUFSCHLUSS UND EXTRAKTION 86
9.3.2. MESSUNG UND AUSWERTUNG 86
10. GASCHROMATOGRAPHIE/MASSENSPEKTROMETRIE 87
10.1. I3C-ISOTOPOLOGANALYSEN: PROBENVORBEREITUNG UND MESSUNG 87
10.1.1. AMINOSAEUREN UND PHB 87
10.1.2. ALGINAT 92
10.2. 13C-ISOTOPOLOGANALYSEN: BERECHNUNG UND DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE
94
10.3. METABOLOMICS 96
M . ERGEBNISSE UND DISKUSSION 99
1. MODELLORGANISMUS DER EXTRAZELLULAEREN INFEKTION - IN VITRO-STUDIEN MIT
YERSINIA
ENTEROCOLITICA............................................
..........................................................99
1.1. DER GLUCOSE-STOFFWECHSEL - IN VITRO-STUDIEN MIT [U- 13C6]GHICOSE
100
1.1.1. I3C-EINBAURATEN IN PROTEINOGENE AMINOSAEUREN 100
1.1.2. ISOTOPOLOGMUSTER 102
1.2. CCVFIXIERUNG IN Y. ENTEROCOLITICA - IN VITRO-STUDIEN MIT NAH 13C03
105
IMAGE 4
XN
TNHALTSVFIR7FIINHNIS
1.2.1. 13C-INKORPORATIONSRATE AUS NAH13C03 105
1.2.2. ISOTOPOLOGMUSTER 106
1.3. DER GLUTAMIN-STOFIWECHSEL - IN VITRO-STUDIEN MIT [U- 13CS]GLUTANIIN
107
1.3.1. 13C-EINBAURATE AUS [U -13C5 ]GLUTAMIN 107
1.3.2. ISOTOPOLOGMUSTER 108
1.4. DISKUSSION 110
1.4.1. VERWERTUNG VON GLUCOSE 110
1.4.2. CCH-FIXIERUNG IN Y. ENTEROCOLITICA 113
1.4.3. GHITAMIN-VERSTOFLWECHSLUNG 116
1.4.4. ZUSAMMENFASSUNG 118
2. MODELLE DER INTRAZELLULAEREN INFEKTION - WACHSTUM VON L. PNEUMOPHILA
PARIS
IN VITRO UND IN VIVO IN A. CASTELLANII. 119
2.1. ERGEBNISSE DER IN VI/RO-STUDIEN VON L. PNEUMOPHILA UND L.
OAKRIDGENSIS 120
2.1.1. WACHSTUMSPHASENUNANBAENGIGE STUDIEN 120
2.1.1.1. 13C-PROFILE VON L. PNEUMOPHILA UND L. OAKRIDGENSIS KULTIVIERT
MIT
[U- 13C 6]GLUCOSE 121
2.1.1.2. 13C-PROFILE VON L. PNEUMOPHILA UND L. OAKRIDGENSIS KULTIVIERT
MIT
[L,2- 13C 2]GHICOSE 128
2.1.1.3. 13C-PROFILE VON L. PNEUMOPHILA UND L. OAKRIDGENSIS KULTIVIERT
MIT
[U- 13C 3]SERIN 133
2.1.1.4. 13C-PROFILE VON L. PNEUMOPHILA KULTIVIERT MIT [U-13C]-STAERKE
138
2.1.1.5. 13C-PROFILE VON L. PNEUMOPHILA KULTIVIERT MIT
[U-13C]-FETTSAEUREN 139
2.1.1.6. DISKUSSION 139
2.1.2. WACHSTUMSPHASENABHAENGIGE STUDIEN 150
2.1.2.1. 13C-GHICOSE UND 13C-SERIN ALS KOHLENSTOFFQUELLEN FUER L.
PNEUMOPHILA 151
2.1.2.2. WACHSTUMSPHASENABHAENGIGE PRODUKTION VON PHB 159
2.1.2.3. DISKUSSION 162
2.2. ERGEBNISSE DER IN V/VO-STUDIEN VON L. PNEUMOPHILA REPLIZIEREND IN
A. CASTELLANII 166
2.2.1. 13C-PROFILE VON^. CASTELLANII 167
2.2.2. 13C-PROFILE VON INTRAZELLULAER REPLIZIERENDEN L. PNEUMOPHILA IN
A. CASTELLANII 171
2.2.3. DISKUSSION 175
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS XIII
2.3. METABOLOMICS-STUDIEN 179
2.3.1. ERGEBNISSE DER H-NMR-ANALYTIK 180
2.3.2. ERGEBNISSE DER GC/MS-ANALYTIK 183
2.3.3. DISKUSSION 187
3. MODULATION DES KOHLENSTOFFMETABOLISMIIS VON PRIMAEREN UND ETABLIERTEN
MAUSMAKROPHAGEN DURCH INFEKTION MIT LISTERIA MONOCYTOGENES 189
3.1. ERGEBNISSE 190
3.1.1. DIFFERENTIELLE 13C-INKORPORATIONSRATE AUS [U-L3C6]GLUCOSE 190
3.1.2. 13C-ISOTOPOLOGMUSTER VON BMM UND J774A.1 MIT [U-13C6]GLUCOSE 193
3.1.3. DIFFERENTIELLE 13C-INKORPORATIONSRATE AUS [U -13C5 ]GLUTAMIN 198
3.1.4. L3C-ISOTOPOLOGPROFILE VON BMM UND J774A.1 MIT [U-13CS ]GLUTAMIN
200
3.1.5. ,3C-PROFILE VON CYTOSOLISCHEN L. MONOCYTOGENES KULTIVIERT IN BMM
UND
J774A.1 203
3.2. DISKUSSION 207
IV. ZUSAMMENFASSUNG 213
V. SUMMARY 217
VI. LITERATURVERZEICHNIS 221
VII. ABBILDUNGS VERZEICHNIS 239
VIN. TABELLENVERZEICHNIS 239
IX. ANHANG 249
1. YERSINIA ENTEROCOSSTICA 249
1.1. [U- 13C6]GLUCOSE-EXPERIMENTE 249
1.2. NAH 13C03-EXPERIMENTE 250
1.3. [U - 13C5 ]GLUTAMIN-EXPERIMENTE 252
2. LEGIONELLA PNEUMOPHILA UND LEGIONELLA OAKRIDGENSIS 253
2.1. EXPERIMENTE MIT [U- 13C6]GLUCOSE 253
2.2. EXPERIMENTE MIT [L,2- 13C2]GLUCOSE 255
2.3. EXPERIMENTE MIT [U - 13C3 ]SERIN 257
2.4. EXPERIMENTE MIT [U- 13C]-STAERKE 259
2.5. EXPERIMENTE MIT [U- 13C]-FETTSAEUREN 260
IMAGE 6
XIV INHALTSVERZEICHNIS
2.6. WACHTUMSABHAENGIGE STUDIEN 260
2.7. IN VIVO STUDIEN - LEGIONELLA PNEUMOPHILA REPLIZIEREND IN
ACANTHAMOEBA CASTELLANII 265
X. DANKSAGUNG 267
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