Sumoylierung und Targeting von ABCA3:
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2012
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I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 DAS ATEMNOTSYNDROM - EINE LUNGENFUNKTIONSSTOERUNG BEI
SURFACTANTMANGEL 1
1.2 ABCA3 - EIN PROTEIN AUS DER FAMILIE DER ABC-TRANSPORTER 3
1.2.1 MOLEKULARER AUFBAU, BEDEUTUNG UND FUNKTION DER ABC-TRANSPORTER 3
1.2.2 DIE SUBFAMILIE DER ABCA-TRANSPORTER 6
1.2.3 AUFBAU UND FUNKTION VON ABCA3 7
1.2.4 ABCA3-MANGEL 9
1.3 SUMOYLIERUNG - EINE SPEZIELLE FORM DER POSTTRANSLATIONALEN
MODIFIKATION 13
1.3.1 MOLEKULARE GRUNDLAGEN 13
1.3.2 SUMOYLIERUNG VON TRANSMEMBRANPROTEINEN 15
1.3.3 SUMOYLIERUNG VON ABC-TRANSPORTERN 17
2 ZIELSETZUNG 18
3 MATERIAL UND METHODEN 19
3.1 MATERIAL 19
3.1.1 GERAETE UND ZUBEHOER 19
3.1.2 AUSGANGSPLASMIDE 20
3.1.3 ENZYME 20
3.1.4 BAKTERIEN UND ZELLEN 20
3.1.5 KULTURMEDIEN 21
3.1.6 ANTIKOERPER 21
3.1.7 CHEMIKALIEN 21
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE STANDARDMETHODEN 22
3.2.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION 22
3.2.2 GELELEKTROPHORESE 23
3.2.3 DNA-AUFREINIGUNG UND ISOLIERUNG VON PLASMIDEN 23
3.2.4 RESTRIKTION 24
3.2.5 LIGATION 24
3.2.6 TRANSFORMATION 25
3.3 ZELLKULTURMETHODEN 26
3.3.1 KULTIVIERUNG VON ADHAERENTEN ZELLEN 26
3.3.2 T RANSIENTE T RANSFEKTION 26
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IMAGE 2
II
3.4 DER YEAST-TWO-HYBRID ASSAY 27
3.4.1 PRINZIP 27
3.4.2 KLONIERUNG DER BINDUNGSPARTNERVEKTOREN 28
3.4.3 HERSTELLUNG VON PLASMIDKONSTRUKTEN MIT MUTIERTEN SUMOSITES 28
3.4.4 DURCHFUEHRUNG DES YEAST-TWO-HYBRID ASSAY 30
3.5 DIE CO-IMMUNPRAEZIPITATION 32
3.5.1 PRINZIP 32
3.5.2 HERSTELLUNG EINES LEERVEKTORS UND VEKTOR-ABCA3 MIT MUTIERTEN
SUMOSITES 33
3.5.3 TRANSFEKTION VON WILDTTYP-UND MUTATIONSPLASMID IN CHO-ZELLEN 36
3.5.4 ZELLLYSE UND IMMUNPRAEZIPITATION 36
3.5.5 AUFTRENNUNG DER PROTEINE DURCH SDS-POLYACRYLAMIDGELE 37
3.5.6 WESTERNBLOT 38
3.6 IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE 40
3.6.1 PRINZIP 40
3.6.2 TRANSFEKTION VON WILDTYP-UND MUTATIONSPLASMID IN A549- UND MLE
12-ZELLEN 40
3.6.3 IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG UND FLUORESZENZMIKROSKOPIE 40
4 ERGEBNISSE 4 2
4.1 ABCA3 ENTHAELT ZWEI MOEGLICHE SUMO-MOTIVE 42
4.2 ANALYSE DER SUMOYLIERUNG VON ABCA3 IM YEAST-TWO-HYBRID SYSTEM 43
4.2.1 KLONIERUNG VON ABCA3-TEILKONSTRUKTEN MIT WILDTYP- UND MUTIERTEN
SUMOSITES 43
4.2.2 SUMOSITES INTERAGIEREN MIT SUMO 1 BIS 4 44
4.3 ANALYSE DER SUMOYLIERUNG VON ABCA3 IN KULTIVIERTEN SAEUGETIERZELLEN
46
4.3.1 ERSTELLUNG EINES EXPRESSIONSPLASMIDS MIT VOLLSTAENDIGER ABCA3 CDNA
MIT MUTIERTEN
SUMOSITES 46
4.3.2 NACHWEIS DER INTERAKTION VON SUMO 2 MIT ABCA3 IN CHO ZELLEN 47
4.4 EINFLUSS DER SUMOYLIERUNG AUF DAS TARGETING VON ABCA3 IN DER ZELLE
49
5 DISKUSSION 53
6 ZUSAMMENFASSUNG 56
7 ANHANG 57
8 LITERATURVERZEICHNIS 61
9 DANKSAGUNG 66
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