Untersuchung der immunstimulatorischen Effekte von Neuromelanin (NM) auf dendritische Zellen und deren Bedeutung in der Pathogenese von Morbus Parkinson:
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INHALTSVERZEICHNIS
1. ZUSAMMENFASSUNG 9
1.1 DIE AKTIVIERUNG VON DENDRITISCHEN ZELLEN DURCH NEUROMELANIN 9
1.2 DER IN VITRO ABBAU DES ASS-PEPTIDES DUR;CH DAS HUMANE INSULIN
DEGRADING ENZYME 9
2. SUMMARV
2.1 NEUROMELANIN ACTIVATES DENDRITIC CELLS 11
2.2 IN VITRO DEGRADATION OF ASS-PEPTIDE BY HUMAN INSULIN DEGRADING ENZYME
11
3. EINLEITUNG 13
3.1 DAS PARKINSON SYNDROM 13
3.2 NEUROMELANIN 14
3.2.1 STRUKTUR UND VERBREITUNG 14
3.2.2 BILDUNG UND FUNKTION 15
3.2.3 NEUROMELANIN IN DER PATHOGENESE VON PARKINSON 17
3.3 REIFUNG UND FUNKTION DENDRITSCHER ZELLEN 18
3.4 ASS IN DER PATHOGENESE VON ALZHEIMER 19
3.5 DAS INSULIN DEGRADING ENZYME (IDE) 20
3.6 ADENO-ASSOZIIERTE VIREN UND FOAMYVIREN ALS VIRALE VEKTOREN DER 22
GENTHERAPIE
3.7 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 25
3.7.1 UNTERSUCHUNG DER IMMUNSTIMULATORISCHEN EFFEKTE VON NEUROMELANIN
(NM) AUF DENDRITISCHE ZELLEN UND DEREN BEDEUTUNG IN DER PATHOGENESE
VON PARKINSON 25
3.7.2 KLONIERUNG EINES HIDE-EXPRIMIERENDEN AAV-VEKTORS ZUR DEGRADIERUNG
VON ASS 25
4. MATERIAL 26
4.1 BAKTERIEN 26
4.2 PRIMER UND OLIGONUKLEOTIDE 26
4.3 PLASMIDE 27
4.4 ENZYME 28
- 5 -
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IMAGE 2
4.5 PUFFER UND LOESUNGEN 29
4.6 WESTERN BLOT 31
4.7 ANTIKOERPER 31
4.8 ZELLLINIEN 32
4.9 BLUTPROBEN 32
4.10 VERSUCHSTIERE 32
4.11 REAGENZIEN FUER ZELLKULTUREN 32
4.12 KITS 33
4.13 CHEMIKALIEN 33
4.14 VERBRAUCHSMATERIALIEN 35
4.15 GERAETE 36
5. METHODEN 38
5.1 BAKTERIEN 38
5.1.1 ANZUCHT VON BAKTERIENKULTUREN 38
5.1.2 HERSTELLUNG VON AGARPLATTEN 38
5.1.3 ANLEGEN VON GLYCERINKULTUREN 38
5.1.4 HITZESCHOCK-TRANSFORMATION VON BAKTERIEN 38
5.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 39
5.2.1 PCR 39
5.2.2 GELELEKTROPHORESE MIT AGAROSEGELEN 40
5.2.3 PRAEPARATIVE AUFREINIGUNG VON PLASMID DNA AUS BAKTERIEN 40
5.2.3.1 MINI-PRAEPARATIONEN MIT DIATOMEENERDE 41
5.2.3.2 MAXI-PRAEPARATIONEN VON PLASMID DNA 41
5.2.4 PCR-REINIGUNG UND GEL-EXTRAKTION 42
5.2.5 PHENOLREINIGUNG VON DNA 42
5.2.6 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA 43
5.2.7 VERDAU VON DNA MIT RESTRIKTIONSENZYMEN 43
5.2.8 5 -DEPHOSPHORYLIERUNG VON PLASMID DNA 44
5.2.9 LIGATION 44
5.2.10 SEQUENZIERUNGSREAKTION 45
5.3 EUKARIOTISCHE ZELLEN 46
5.3.1 EINFRIEREN VON ZELLEN 47
5.3.2 AUFTAUEN VON ZELLEN 47
5.3.3 PASSAGIEREN VON ADHAERENTEN ZELLEN 47
5.3.4 ZELLDICHTEBESTIMMUNG 48
- 6 -
IMAGE 3
5.3.5 TRANSFEKTION MIT POLYETHYLENIMIN 49
5.3.6 ISOLIERUNG VON HAEMATOPOETISCHEN STAMMZELLEN AUS MURINEM
KNOCHENMARK 51
5.3.7 PRAEPARATION VON MURINEN LYMPHKNOTEN 51
5.3.8 ISOLIERUNG VON PERIPHAEREN, MONONUKLEAEREN BLUTZELLEN MITTELS
EINER FICOLL-DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION 53
5.3.9 GENERIERUNG VON DENDRITISCHEN ZELLEN (DZ)
A) AUS MURINEN HSC 53
B) AUS HUMANEN PBMC 53
5.3.10 AKTIVIERUNG DENDRITISCHER ZELLEN MIT NEUROMELANIN UND
DOPAMINMELANIN 54
5.3.11 T-ZELL PROLIFERATIONSTEST 55
5.4 MIKROSKOPIE 56
5.4.1 FLUORESZENZMIKROSKOPIE 56
5.4.2 KONFOKALMIKROSKOPIE 56
5.5 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 57
5.6 IMMUNOCHEMISCHE METHODEN 57
5.6.1 IMMUNOASSAY ZUM NACHWEIS VON DAM-ANTIKOERPERN 57
5.6.2 AGGLUTINATIONSTEST ZUM NACHWEIS VON DAM-ANTIKOERPERN 58
5.6.3 ELISA ZUR QUANTITATIVEN BESTIMMUNG VON ZYTOKINKONZENTRATIONEN 58
5.7 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 59
5.7.1 GEWINNUNG VON PROTEINLYSATEN AUS ZELLKULTUREN 59
5.7.2 PROTEINBESTIMMUNG NACH DRADFORD 59
5.7.3 DENATURIERENDE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 60
5.7.4 WESTERN BLOT 61
5.7.5 TEST AUF LPS VERUNREINGUNG MIT LIMULUS AMEBOCYTE LYSATE (LAL) 62
5.7.6 EXTRAZELLULAERE ANTIKOERPERFAERBUNG VON ZELLOBERFLAECHENPROTEINEN 63
5.7.7 INTRAZELLULAERE ANTIKOERPERFAERBUNG VON PROTEINEN 63
6. ERGEBNISSE 64
6.1 REIFUNGEN VON DENDRITISCHEN ZELLEN DURCH STIMULATION MIT NM 64
6.1.1 KEINE LPS-VERUNREINIGUNG IN DAM UND NM 64
6.1.2 MURINE UND HUMANE DZ PHAGOZYTIEREN DAM UND NM 65
6.1.3 NUR NM UND NICHT DAM LAESST MDZ SPONTAN REIFEN 69
6.1.4 DAM ZEIGT AUCH BEI HDZ KEINE WIRKUNG 72
6.1.5 NM STIMULIERT DIE AUSSCHUETTUNG VON IL-6 UND TNF-A BEI MDZ 73
6.1.6 MIT NM BEHANDELTE MDZ LASSEN T-ZELLEN PROLIFERIEREN 75
- 7 -
IMAGE 4
6.2 IN DAM-IMMUNISIERTEN KANINCHEN KONNTEN KEINE ANTI-DAM-ANTIKOERPER
NACHGEIWESEN WERDEN 82
6.3 DIE PLASMIDKLONIERUNGEN FUER EIN AAV BASIERTES IN VITRO-T ESTSYSTEM
ZUM ABBAU VON ASS DURCH HIDE 84
6.3.1 KLONIERUNG VON BF014-HAPP 84
6.3.2 KLONIREUNG VON PAAV-HLDE-MRFP 85
7. DISKUSSION 88
7.1 DIE UNTERSUCHUNG DER IMMUNSTIMULATORISCHEN EFFEKTE VON DAM
UND NM AUF DENDRITISCHE ZELLEN 88
7.1.1 ENDOTOXINTEST VON DAM UND NM 88
7.1.2 DIE GENERIERUNG VON MDZ UND HDZ IM VERGLEICH 89
7.2.2 DIE MELANINE DAM UND NM 90
7.2.3 DIE PHAGOZYTOSE VON NM LAESST MDZ REIFEN 90
7.2.4 NM REGT BEI MDZ DIE AUSSCHUETTUNG VON ZYTOKINEN AN 91
7.2.5 DURCH NM AKTIVIERTE MDZ REGEN ALLOGENE MTZ ZUR PROLIFERATION AN 92
7.2.6 NM UND HDZ 93
7.2.7 ZYTOTOXISCHE WIRKUNG VON DAM AUF HDZ 94
7.2 IMMUNOASSAY ZUM NACHWEIS VON ANTI-DAM-IGG 94
7.3 NEUROMELANIN ALS MOEGLICHER AUSLOESER EINER AUTOIMMUNITAET BEI MP 96
7.4 DER IN VITRO ABBAU VON ASS DURCH HIDE 98
7.4.1 DIE ERZEUGUNG EINER ZELLLINIE MIT STABILER EXPRESSION VON HAPP WT,
SW 98
7.4.2 DIE KLONIERUNG EINES PAAV-HLDE-PLASMIDS 98
7.4.3 DIE KLONIERUNG VON HIDE SEQUENZ IN DAS FOAMYVIRALE PLASMID BF014
99
8. LITERATURVERZEICHNIS 100
9. PUBLIKATIONEN 107
10. ABKUERZUNQSVERZEICHNIS 108
11. ABBILDUNASVERZEICHNIS 110
- 8 -
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