Untersuchung des Rezeptor-vermittelten Aufnahmemechanismus von Parvovirus B19 bei der endothelialen Parvovirus-B19-Infektion und Adenovirus-induzierte Reaktivierung von Parvovirus B19 in Endothelzellen:
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INHALTSVERZEICHNIS 3
1 EINLEITUNG 6
1.1 PARVOVIRUS B19 (B19V) 6
1.1.1 TAXONOMISCHE EINORDNUNG VON B19V 6
1.1.2 MORPHOLOGIE 7
1.1.3 GENOMSTRUKTUR UND -ORGANISATION 8
1.1.4 VIRUSPROTEINE 10
1.1.4.1 NICHTSTRUKTURPROTEINE 10
1.1.4.2 S TRUKTURPROTEINE 11
1.1.5 B19V-REZEPTOR-WECHSELWIRKUNGEN UND -AUFNAHMEMECHANISMEN 11 1.1.5.1
BLUTGRUPPEN P-ANTIGEN 11
1.1.5.2 ASSSI-INTEGRIN 12
1.1.5.3 KU80-AUTOANTIGEN 13
1.1.5.4 B19V-AUFNAHMEMECHANISMEN 14
1.1.6 REPLIKATION 15
1.1.7 EPIDEMIOLOGIE UND UEBERTRAGUNG 17
1.1.8 PATHOGENESE UND TROPI SMUS 17
1.1.9 KRANKHEITSBILDER 19
1.1.9.1 B19V-ASSOZIIERTE INFLAMMATORISCHE KARDIOMYOPATHIE 19
1.2 ADENOVIRALE HELFERFUNKTIONEN BEI DER PARVOVIMSINFEKTION 22
1.3 ZIELSETZUNGEN 23
2 MATERIAL 24
2.1 BAKTERIENSTAEMME 24
2.2 BAKTERIEN-MEDIEN 24
2.3 PLASMIDE 24
2.4 EUKARYOTISCHE ZELLEN 27
2.5 ANTIKOERPER 27
2.5.1 PRIMAERE ANTIKOERPER 27
2.5.2 SEKUNDAERE ANTIKOERPER 28
2.6 ENZYME 28
2.7 NUKLEINSAEURE 29
2.7.1 OLIGONUKLEOTIDE 29
2.7.2 TAQ-MAN SONDEN 29
2.7.3 DNA-GROESSENSTANDARDS 29
2.8 REAGENZSYSTEME 30
2.9 LOESUNGEN UND PUFFER 30
2.10 GERAETE 31
2.11 CHEMIKALIEN 32
2.12 ANTIBIOTIKA 35
2.13 VIREN UND VIRALE VEKTOREN 35
2.13.1 VIREN 35
2.13.2 VIRALE VEKTOREN 36
2.14 SONSTIGE MATERIALIEN 36
2.15 SOFTWARE 36
3 METHODEN 38
3.1 ARBEITEN MIT BAKTERIEN 38
3.1.1 HERSTELLUNG CHEMOKOMPETENTER BAKTERIEN 38
3.1.2 TRANSFORMATION CHEMOKOMPETENTER BAKTERIEN 38
3.1.3 KONSERVIERUNG VON BAKTERIENZELLEN 39
3.2 DNA- UND RNA-TECHNIKEN 39
3.2.1 DNA-ISORIERUNG AUS BAKTERIEN 39
3.2.1.1 PLASMIDPRAEPARATION IN KLEINEM MASSSTAB (MINIPRAEPARATION) 39
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS 3
3.2.1.2 PLASMIDPRAEPARATION IN GROSSEM MASSSTAB (MAXIPRAEPARATION) 39
3.2.2 ISOLIERUNG EUKARYOTISCHER DNA AUS ZELLEN 40
3.2.3 ISOLIERUNG VIRALER DNA 40
3.2.4 ISOLIERUNG NIEDERMOLEKULARER DNA AUS EUKARYOTISCHEN ZELLEN 40
3.2.5 DNA-EXTRAKTION DURCH PHENOL-CHLOROFORM 41
3.2.6 DNA-EXTRAKTION AUS EINEM AGAROSEGEL 41
3.2.7 DNA-FAELLUNG 41
3.2.8 GELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA 42
3.2.9 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS EUKARYOTISCHEN ZELLEN 42
3.2.10 BESTIMMUNG DER NUKLEINSAEUREKONZENTRATION 43
3.3 DNA-REKOMBINATIONSTECHNIKEN 43
3.3.1 RESTRIKTIONSANALYSE 43
3.3.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 43
3.3.3 PHOSPHORYLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 44
3.3.4 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 44
3.4 POLYMERASEKETTENREAKTION 45
3.4.1 PRINZIP DER DNA-AMPLIFIKATION MITTELS PCR 45
3.4.2 DNA-AMPLIFIZIERUNG MITTELS PCR 45
3.4.3 PRINZIP DER QUANTITATIVEN REAL-TIME-PCR 46
3.4.4 QUANTITATIVE REAL-TIME-PCR 47
3.4.5 REVERSE-TRANSKRIPTASE-POLYMERASEKETTENREAKTION 50
3.4.6 SEQUENZIERUNG VON DNA 50
3.5 PLASMID-KONSTRUKTION 51
3.6 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 51
3.6.1 KULTIVIERUNG VON ZELLEN 51
3.6.2 ZELLZAHLBESTIMMUNG 52
3.6.3 KONSERVIERUNG UND REAKTIVIERUNG VON ZELLEN 52
3.6.4 TRANSFEKTION EUKARYONTISCHER ZELLEN 53
3.7 VIROLOGISCHE METHODEN 54
3.7.1 B19V-EXTRAKTION AUS SERUM 54
3.7.2 BESTIMMUNG DER BIOLOGISCH AKTIVEN ADENOVIRALEN
PARTIKELKONZENTRATION 54 3.7.3 INFEKTION VON ZELLKULTUREN 55
3.7.3.1 KO-INFEKTION VON B19V UND AD2 BZW. AD5 55
3.7.3.2 INFEKTION MIT AD2 BZW. AD5 MIT ANSCHLIESSENDER TRANSFEKTION 55
3.8 NACHWEISMETHODEN DER PROTEINEXPRESSION 56
3.8.1 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 56
3.8.2 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ 57
3.8.3 LUCIFERASE-ASSAY 58
3.9 TRANSFER UND NACHWEIS VON NUKLEINSAEUREN AUF NYLONMEMBRANEN 58
3.9.1 DNA-TRANSFER MITTELS SOUTHERN-BLOT 58
3.9.2 KAPILLAR-BLOT 59
3.9.3 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 60
3.9.4 REINIGUNG RADIOAKTIV MARKIERTER SONDEN 60
3.9.5 HYBRIDISIERUNG VON NUKLEINSAEUREN MIT MARKIERTEN DNA-FRAGMENTEN 61
3.9.6 NACHWEIS UND QUANTIFIZIERUNG DER HYBRIDISIERUNGSPRODUKTE 61
3.9.7 WASCHEN RADIOAKTIV MARKIERTER DNA-FRAGMENTE 61
3.10 STATISTISCHE EVALUIERUNG 62
4 ERGEBNISSE 63
4.1 REZEPTOR-VERMITTELTE BINDUNG UND INTERNALISIERUNG VON B19V 63
4.1.1 ANALYSE DER B19V REZEPTOREXPRESSION IN ENDOTHELZELLEN 63
4.1.2 B19V-BINDUNG UND -INTERNALISIERUNG IN ENDOTHELZELLEN 69
IMAGE 3
I
; INHALTSVERZEICHNIS 3
4.1.3 EINFLUSS DER POLARITAET VON ENDOTHELZELLEN AUF DIE B19V-INFEKTION
71
4.1.4 EINFLUSS DER SSI-INTEGRIN-AKTIVIERUNG AUF DIE B19V-INTERNALISIERUNG
73 4.2 ADENOVIRUS-INDUZIERTE B19V-TRANSAKTIVIERUNG 74
4.2.1 B19V PROTEIN-EXPRESSION NACH KO-INFEKTION MIT ADENOVIRUS 75
4.2.2 EINFLUSS DER ADENOVIRUS KO-INFEKTION AUF DIE B19V-AUFHAHME UND
FREISETZUNG DER B19V-DNA.; 78
4.2.3 EINFLUSS DER ADENOVIRALEN EIA-PROTEINE AUF DIE
B19V-PROTEINEXPRESSION 81 4.2.4 ADENOVIRUS-VERMITTELTE TANSAKTIVIERUNG
DES ISOLIERTEN B19V P6-PROMOTORS IM KONTEXT EINES EINZELSTRAENGIGEN
GENOMS 83
4.2.5 TRANSAKTIVIERENDE WIRKUNG VON ADENOVIRUS AUF DEN ISOLIERTEN
P6-PROMOTOR. 86 4.2.5.1 TRANSAKTIVIERENDE WIRKUNG ADENOVIRALER
FUNKTIONEN UND B19V-NS1 AUF DEN ISOLIERTEN P6-PROMOTOR 88
4.2.5.2 ANALYSE ZUR TRANSAKTIVIERENDEN WIRKUNG DER ADENOVIRALEN
FUNKTIONEN DES PHELPER-PLASMIDS 92
4.2.6 TRANSAKTIVIERENDE FUNKTION DER EIA-PROTEINE 94
4.2.7 SYNTHESE VON B19V DNA-REPLIKATIONSINTERMEDIATEN NACH KO-INFEKTION
MIT ADENOVIRUS IN ENDOTHELZELLEN 97
5 DISKUSSION 100
5.1 REZEPTOR-VERMITTELTE B19V-BINDUNG UND -INTERNALISIERUNG IN
ENDOTHELZELLEN 101 5.1.1 ANALYSE DER B19V-BINDUNG UND -INTERNALISIERUNG
IN ENDOTHELZELLEN 102 5.1.2 EINFLUSS DER POLARITAET VON ENDOTHELZELLEN
AUF DIE B19V-INTERNALISIERUNG 104 5.1.3 EINFLUSS DER
SSI-INTEGRIN-AKTIVIERUNG AUF DIE B19V-INTERNALISIERUNG 105
5.1.4 ALTERNATIVE B19V-AUFNAHMEMECHANISMEN IN ENDOTHELZELLEN 105
5.2 REAKTIVIERUNG VON B19V DURCH ADENOVIRUS 106
5.2.1 EINFLUSS DER ADENOVIRUS KO-INFEKTION AUF DIE B19
V-PROTEINEXPRESSION IN ENDOTHELZELLEN 107
5.2.2 EINFLUSS DER ADENOVIRALEN EIA-PROTEINE AUF DIE
B19V-PROTEINEXPRESSION.... 110 5.2.3 ANALYSE ZUR ROLLE DER
PHELPER-FUNKTIONEN IN DER TRANSAKTIVIERUNG DES P6PROMOTORS 111
5.2.4 ANALYSE CIS-REGULATORISCHER DOMAENEN DES P6-PROMOTORS 113
5.2.5 EINFLUSS VON NS1 AUF DIE B19V-PROMOTORAKTIVITAET 115
5.2.6 SYNTHESE VON B19V DNA-REPLIKATIONSINTERMEDIATEN NACH KO-INFEKTION
MIT ADENOVIRUS IN ENDOTHELZELLEN 115
5.2.7 PHYSIOLOGISCHE RELEVANZ DER ADENOVIRALEN TRANSAKTIVIERUNG VON B19V
117 6 ZUSAMMENFASSUNG 118
7 SUMMARY 121
8 LITERATUR 123
9 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 140
10 ANHANG 142
1 1 DANKSAGUNG 146
12 PUBLIKATIONSLISTE 147
LEBENSLAUF 148
ERKLAERUNG 149
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