Der phytopathogene Schadpilz Heterobasidion annosum s. l. und dessen 14-3-3-Proteine mit ihren Bindepartnern: Beeinflussung der Bindepartner durch ein Bodenbakterium mit Biokontroll-Funktion
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1. EIN KURZBLICK AUF DIE RHIZOSPHAERE 1
1.2. DER PHYTOPATHOGENE, NEKROTROPHE SCHADPILZ HETEROBASIDION SP 2
1.3. DAS BIOKONTROLLBAKTERIUM STREPTOMYCES SP. ACH 505 7
1.4. DIE 14-3-3-PROTEIN-FAMILIE 9
1.4.1. DIE STRUKTUR DES 14-3-3-PROTEINS 10
1.4.2. DIE 14-3-3S DER VERSCHIEDENEN EUKARYOTISCHEN ORGANISMEN 11
1.4.3. DIE PILZLICHEN 14-3-3-PROTEINE 12
1.4.4. BEKANNTE INTERAKTIONEN VON 14-3-3 UND EIGENSCHAFTEN DER
BINDEPARTNER 14
1.5. ZIEL DER ARBEIT 15
2. METHODEN 17
2.1. VERWENDETE ORGANISMEN 17
2.2. MEDIEN, GELZUSAMMENSETZUNGEN, PUFFER UND LOESUNGEN 18
2.3. ANZUCHTBEDINGUNGEN 18
2.3.1. ANZUCHT DER PILZSTAEMME H. IRREGULAERE TC32.1 UND H. ANNOSUM 005
UND DES BODENBAKTERIUMS STREPTOMYCES ACH 505 18
2.3.2. DUALKULTUREN DER BEIDEN ORGANISMEN 19
2.4. DATENBANKANALYSE 19
2.5. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 20
2.5.1. RNA-ISOLATION 20
2.5.2. RNA-FORMALDEHYDGEL UND NORTHERN-BLOT 20
2.5.3. HERSTELLUNG EINER DIGOXIGENIN-MARKIERTEN SONDE UND DIE
HYBRIDISIERUNG 21
2.5.4. DIE CDNA-SYNTHESE 23
2.5.5. ISOLIERUNG VON ORFS AUS H. IRREGULAERE TC32.1 25
2.5.6. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) MIT DER PHUSION-DNA-POLYMERASE 25
2.5.7. AUFTRENNUNG VON DNA MITTELS GELELEKTROPHORESE 26
2.5.8. ELUTION DER DNA AUS AGAROSEGELEN 26
2.5.8.1. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA 27
2.5.9. KLONIERUNG VON DNA 27
2.5.9.1. LIGATION IN DEN PIASMID-VEKTOR PJET1.2/BLUNT 27
2.5.9.2. KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSVEKTOREN 27
2.5.9.2.1. KONSTRUKTION VON DEN EXPRESSIONSVEKTOREN FUER F . COLI 28
2.5.9.2.2. KONSTRUKTION VON DEN EXPRESSIONSVEKTOREN FUER HEFE PJ69-4A 29
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IMAGE 2
2.5.9.2.3. KONSTRUKTION DER EXPRESSIONSVEKTOREN FUER DIE
PARTICLE-LNFLOW-GUN -METHODE 30
2.5.9.2.4. RESTRIKTIONSVERDAU 30
2.6. HERSTELLUNG VON KOMPETENTEN E. CO//-ZELLEN DER STAEMME TOP F10 UND
BL21DE3 3 1
2.7. KLONIERUNGS- UND EXPRESSIONSSYSTEME 32
2.7.1. ANZUCHTBEDINGUNGEN VON E. COLI STAMM TOP F10 UND STAMM BL21DE3
32
2.7.1.1. TRANSFORMATIONS- UND SELEKTIONSBEDINGUNGEN 32
2.7.1.2. INDUKTION DER HETEROLOGEN 14-3-3-PROTEINEXPRESSION DURCH IPTG
33
2.7.1.3. AUFREINIGUNG DER HETEROLOG EXPRIMIERTEN PROTEINE 33
2.7.2. SACCHAROMYCES CEREVISIAE PJ69-4A 34
2.7.2.1. AUFZUCHT DES HEFESTAMMES PJ69-4A 34
2.7.2.2. TRANSFORMATION MIT DEN POTENZIELLEN BINDEPARTNERN 35
2.7.2.3. DURCHFUEHRUNG VON TROPFTEST MIT DER TRANSFORMIERTEN HEFE 35
2.7.2.4. EXPRESSIONSTEST DER PROTEINE IM STAMM PJ69-4A 36
2.7.3. DNA-MINIPRAEPARATION 36
2.7.4. DNA-SEQUEN2IERUNG 37
2.8. PROTEINANALYTIK 37
2.8.1. AUFREINIGUNG VON PHOSPHOPROTEINEN UND GESAMTPROTEIN 37
2.8.2. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN 38
2.8.3. COAFFINITAETSAUFREINIGUNG VON PROTEINEN 39
2.8.4. DIE AUSWERTUNG DER AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE MITTELS
DATENBANKANALYSE 40
2.8.5. 1D-SDS-PAGE UND 2D-SDS-PAGE 40
2.8.6. FAERBUNG VON POLYACRYLAMIDGELEN 4 1
2.8.6.1. COOMASSIE-FAERBUNG 4 1
2.8.6.2. SILBER-FAERBUNG 4 1
2.8.6.3. PRO Q DIAMOND-FAERBUNG 42
2.8.6.4. SYPRO-RUBY-FAERBUNG 42
2.8.7. WESTERN-BLOT/FAR-WESTERN-BLOT UND IMMUNDETEKTION 42
2.9. ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 45
2.9.1. PARTICLE-LNFLOW-GUN -METHODE ( PIG -METHODE) 45
2.9.2. MIKROSKOPIE 46
3. ERGEBNISSE 4 7
3.1. DIE PILZSTAEMME H. ANNOSUM 005 UND H. IRREGULAERE TC32.1 IN EINER
DUALKULTUR
MIT DEM STREPTOMYCETEN ACH 505 47
3.2. UNTERSCHIEDE BEI DER PROTEINEXPRESSION IN H. ANNOSUM 005 NACH
INKUBATION
MIT ZELLFREIEM KULTURUEBERSTAND VON ACH 505 49
3.3. WACHSTUMSTEST DES NORDAMERIKANISCHEN H. IRREGULAERE TC32.1 UND DES
EUROPAEISCHEN H. ANNOSUM 005 M I T WS-5995 B 5 1
3.4. UNTERSCHIEDE IN DER PROTEINEXPRESSION IN HETEROBASIDION IRREGULAERE
TC32.1
NACH INKUBATION MIT DEM ANTIBIOTIKUM WS-5995 8 53
IMAGE 3
3.5. DIE ZWEI 14-3-3-PROTEINE AUS HETEROBASIDION SP. (H. ANNOSUM 005 UND
H.
IRREGULAERE TC32.1) 59
3.5.1. DIE 14-3-3-EXPRESSION NACH INKUBATION DES EUROPAEISCHEN PILZES H.
ANNOSUM 005 MIT WS- 5995 B 6 1
3.5.2. DIE 14-3-3ATUE-EXPRESSION DES NORDAMERIKANISCHEN PILZES H.
IRREGULAERE TC32.1 NACH
VERAENDERUNG DES MEDIUMS 62
3.5.3. DIE LOKALISATION VON 14-3-3ATUE 63
3.5.4. DIE ANZUCHT DES E. COLI STAMMES BL21DE3 MIT DEN PROTEINEN
14-3-3ATUE UND 14-3-3BTUE FUER DIE AFFINITAETSCHROMATOGRAFIE 64
3.5.5. DIE EXPRESSIONSUEBERPRUEFUNG 14-3-3ATUE UND 14-3-3BTUE MITTELS
WESTERN-BLOT 65
3.6. SUCHE NACH POTENZIELLEN PILZLICHEN 14-3-3ATUE-LNTERAKTIONSPARTNERN
66
3.6.1. ANSATZ 1: AFFINITAETSANALYSE DES GESAMTEN PROTEINS AUS H.
IRREGULAERE TC32.1 MIT 14-3-3ATUE ALS LIGAND 67
3.6.1.1. AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE DER MASSENSPEKTROMETRIEANALYSE 68
3.6.1.2. SPEKTRUMSVERAENDERUNG DER INTERAKTIONSPARTNER FUER 14-3-3ATUE NACH
BEHANDLUNG MIT DEM FUNGIZID WS-5995 B 70
3.6.2. ANSATZ 2: ANALYSE DER DATENBANK JGI MIT HILFE DES 1. BINDEMOTIVS
FUER 14-3-3-PROTEINE 76 3.6.2.1. VERIFIZIERUNG DER DATEN AUS ANSATZ 2 MIT
HILFE DES HEFE2HYBRID-SYSTEMS 78
3.6.3. ANSATZ 3: FAR-WESTERN-BLOT MIT PROTEIN 14-3-3ATUE UND DEM PILZ H.
ANNOSUM 005 82
4. DISKUSSION 85
4.1. H. ANNOSUM 005 VS. H. IRREGULAERE TC32.1 - REAKTIONEN AUF DEN
STREPTOMYCETEN ACH 505 UND DAS WS-5995 B 85
4.2. CHARAKTERISIERUNG DER BEIDEN 14-3-3-PROTEINE AUS H. IRREGULAERE
TC32.1:
SEQUENZVERGLEICH MIT BEKANNTEN 14-3-3-PROTEINEN UND EXPRESSION 88
4.3. HETEROLOGE EXPRESSION DER BEIDEN 14-3-3-PROTEINE AUS H. IRREGULAERE
TC32.1 92
4.4. IDENTIFIKATION VON 14-3-3ATUE-BINDENDEN PROTEINEN AUS H. IRREGULAERE
TC32.1 93
5. ZUSAMMENFASSUNG 1 0 1
6. LITERATURVERZEICHNIS 103
IMAGE 4
7. ANHANG 117
7.1. REZEPTE DER PUFFER, GELE UND MEDIEN 117
7.2. VEKTORKARTEN ALLER IN DIESER ARBEIT VERWENDETEN VEKTOREN 125
7.3. PROTEINLISTE DER SPOTANALYSE 127
7.4. PROTEINE DER COAFFINITAETSAUFREINIGUNG 130
7.5. DIE PROTEIN-IDS DER BREITER ANGELEGTEN COAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
132
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