Rekombinante Ektromelieviren zur Expression des Fluoreszenzmarkers mCherry:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Giessen
DVG Service
2012
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
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| Beschreibung: | IX, 133 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS IV
INHALTSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG 1
II. LITERATURUEBERSICHT 3
1. DIE GESCHICHTE DER POCKENVIREN 3
2. DIE FAMILIE DER POCKENVIREN 4
3. DER AUFBAU VON POCKENVIREN 5
4. DAS VIRUSGENOM 7
5. DER LEBENSZYKLUS DER POCKENVIREN 8
6. VIRALE TRANSKRIPTION UND MORPHOGENESE 9
7. DNA-REPLIKATION 11
8. PATHOGENESE VON INFEKTIONEN MIT POCKENVIREN 12
9. EKTROMELIEVIRUS, DER ERREGER DER MAEUSEPOCKEN 14
10. PATHOGENESE UND PATHOLOGIE DER EKTROMELIE-INFEKTION 14
11. BIOLOGIE, GENETIK UND EMPFAENGLICHKEIT 17
12. DIE MAEUSEPOCKEN ALS MODELL FUER DIE VARIOLA VERA DES
MENSCHEN 19
13. ECTV ALS MODELL ZUR UNTERSUCHUNG VON VIRUS-WIRT-INTERAKTION...20
14. DAS MAEUSEPOCKENINFEKTIONSMODELL IN DER PHARMAZEUTISCHEN
FORSCHUNG 21
15. DIE VERWENDUNG VON FLUORESZIERENDEN PROTEINEN IM
VIRUSINFEKTIONSMODELL 23
16. DAS GRUEN-FLUORESZIERENDE PROTEIN GFP 25
17. ROT-FLUORESZIERENDE PROTEINE 28
18. ZIELSETZUNG DER ARBEIT 31
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS V
III. MATERIAL UND METHODEN 32
1. CHEMIKALIEN 32
2. PUFFER, LOESUNGEN UND NAEHRMEDIEN 33
3. NAEHRMEDIEN UND ZUSAETZE 34
4. NICHT MARKIERTE ANTIKOERPER 34
5. MARKIERTE ANTIKOERPER 34
6. BAKTERIENSTAEMME 35
7. PRIMER 35
8. PLASMIDE 36
9. VIREN 36
10. ZELLKULTUR 36
10.1. KULTIVIERUNG PERMANENTER ZELLEN 36
10.2. GEWINNUNG UND KULTIVIERUNG PRIMAERER ZELLEN 37
10.2.1. MILZZELLEN 37
10.2.2. MYELOIDE DENDRITISCHE ZELLEN 37
10.2.3. DIFFERENZIERUNG PRIMAERER MAKROPHAGEN 38
10.2.4. KULTIVIERUNG UND PASSAGIERUNG VON ZELLKULTUREN 38
10.3. EINFRIEREN UND AUFTAUEN DER ZELLEN 38
10.4. BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 39
10.5. INFEKTION VON ZELLEN 39
11. GEWINNUNG VON VIRUSMATERIAL 4 0
11.1. VIRUSMATERIAL FUER LAGERUNG UND IN VITRO EXPERIMENTE 40
11.2. BESTIMMUNG DER INFEKTIOSITAET VIRUSHALTIGER SUSPENSIONEN 40
11.3. HERSTELLUNG REKOMBINANTER VIREN 41
11.4. TRANSFEKTION VIRUSINFIZIERTER ZELLEN 41
11.5. KLONALE ISOLIERUNG REKOMBINANTER VIREN IN DER ZELLKULTURPASSAGE 42
12. UNTERSUCHUNG DER VERMEHRUNGSFAEHIGKEIT VON EKTROMELIVIRUS ....42
12.1. MEHRSCHRITT-WACHSTUMSKURVE 42
13. MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITSMETHODEN 4 3
13.1. KULTIVIERUNG VON KOMPETENTEN BAKTERIEN 43
13.2. TRANSFORMATION KOMPETENTER BAKTERIEN 43
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS VI
13.3. ANIMPFEN VON FLUESSIGKULTUREN ZUR MINIPRAEPARATION VON
PLASMID-DNA 44
13.4. ANIMPFEN VON FLUESSIGKULTUREN ZUR MAXIPRAEPARATION VON
PLASMID-DNA 44
14. DNA- METHODEN 44
14.1. PRAEPARATION VON PLASMID DNA 4 4
14.2. PRAEPARATION VON KOMPLETT-DNA AUS VIRUSINFIZIERTEN ZELLEN 45
14.3. PRAEPARATION ZYTOPLASMATISCHER DNA 45
14.4. PHENOL/CHLOROFORM EXTRAKTION 46
14.5. QUALITAETSKONTROLLE ISOLIERTER DNA 46
14.6. RESTRIKTIONSANALYSE 47
14.7. TRENNUNG VON DNA FRAGMENTEN MIT AGAROSE-GEL-ELEKTROPHORESE ....47
14.8. ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS DEM AGAROSE-GEL 48
14.9. ISOLIERUNG VON DNA AUS RESTRIKTIONS-BZW. LIGATIONSANSAETZEN 48
14.10. LIGATIONSANSATZ 48
14.11. DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA 49
14.12. POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 49
14.13. PCR ZUR UNTERSUCHUNG VIRALER DNA 51
14.14. SEQUENZANALYSE KLONIERTER DNA 51
15. PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 52
15.1. HERSTELLUNG VON PROTEINEXTRAKTEN AUS KULTIVIERTEN ZELLEN 52
15.2. BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 52
15.3. WESTERN BLOT 52
15.4. HERSTELLUNG VON SDS-PAGE-GELEN (GROESSE 135X115X1,5MM) 52
15.4.1. NATRIUMDODEZYLSULFAT-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE) 53
15.4.2. MEMBRANTRANSFER 54
15.4.3. IMMUNODETEKTION VON PROTEINEN 55
15.4.4. DURCHFLUSSZYTOMETRIE 56
IV. ERGEBNISSE 57
1. KONSTRUKTION DES MCHERRY-EXPRESSIONSVEKTOR 57
1.1. IDENTIFIZIERUNG DER INSERTIONSSTELLE IM ECTV-GENOM 57
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
VII
1.2. KLONIERUNG VON FLANKIERENDEN ECTV-GENSEQUENZEN UND DER
MCHERRY-EXPRESSIONSKASSETTE 59
1.3. CHARAKTERISIERUNG DES MCHERRY-EXPRESSIONSPLASMIDS IN
RESTRIKTIONSANALYSE UND TRANSIENTER EXPRESSION 64
2. KONSTRUKTION REKOMBINANTER ECTV ZUR EXPRESSION VON
MCHERRY 68
2.1. GENERIERUNG REKOMBINANTER VIREN NACH DNA-TRANSFEKTION UND
ECTV-INFEKTION 68
2.2. ISOLIERUNG KLONALER ECTV-MCHERRY DURCH PLAQUESPASSAGEN 69
2.3. MOLEKULARE CHARAKTERISIERUNG DER FINALEN ECTV-MCHERRY ISOLATE 74
3. CHARAKTERISIERUNG DER ECTV-MCHERRY IM INFEKTIONS-EXPERIMENT
IN ZELLKULTUR 74
3.1. REKOMBINANTE GENEXPRESSION IN MA-104-ZELLEN 74
3.2. WACHSTUMSANALYSE IN MA-104-ZELLEN 79
3.3. WACHSTUMSANALYSE UND REKOMBINANTE GENEXPRESSION IN
ETABLIERTEN ZELLLINIEN DER MAUS 81
3.4. WACHSTUMSANALYSE UND REKOMBINANTE GENEXPRESSION IN PRIMAEREN
MILZ- UND KNOCHENMARKSZELLEN DER MAUS 88
V. DISKUSSION 95
1. IDENTIFIZIERUNG EINES GEEIGNETEN INSERTIONSLOKUS IM
ECTV GENOM 95
2. HERSTELLUNG UND KLONALE ISOLIERUNG REKOMBINANTER
EKTROMELIEVIREN ZUR EXPRESSION VON MARKERGENEN 99
3. VERGLEICHENDE CHARAKTERISIERUNG DER VEKTORVIREN HINSICHTLICH
MCHERRY SYNTHESE NACH IN VITRO INFEKTION 104
4. VERGLEICHENDE CHARAKTERISIERUNG DER REPLIKATIONSFAEHIGKEIT DER
REKOMBINANTEN VIREN NACH IN-VITRO-LNFEKTION 107
5. SCHLUSSFOLGERUNG 114
6. AUSBLICK 115
6.1. IN VIVO INFEKTION 115
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS VIII
VI. ZUSAMMENFASSUNG 117
VII. SUMMARY 119
VIII. LITERATURVERZEICHNIS 121
IX. ANHANG 125
1. GERAETE 125
2. KOMMERZIELL ERHAELTLICHE REAGENTIEN, KITS UND STANDARDS 126
3. SEQUENZVERGLEICH DER VACCINIAVIRUS MVA GENE MIT DEN
EKTROMELIEVIRUS STAMM MOSKAU GENEN 127
3.1. VACCINIAVIRUS MVA ORF I8R MIT DEM HOMOLOG EVM063 DES
EKTROMELIEVIRUS STAMM MOSKAU 127
3.2. VACCINIAVIRUS MVA ORF G1L MIT DEM HOMOLOG EVM064 DES
EKTROMELIEVIRUS STAMM MOSKAU 130
4. VERGLEICH DER AMINOSAEURENABFOLGE DER VACCINIA MVA PROTEINE
MIT DEN HOMOLOGEN DES EKTROMELIEVIRUS STAMM MOSKAU 131
4.1. AMINOSAEUREVERGLEICH DES VACCINIAVIRUS MVA PROTEIN I8R MIT DEM
EKTROMELIE STAMM MOSKAU PROTEIN EVM063 131
4.2. AMINOSAEUREVERGLEICH DES VACCINIAVIRUS MVA PROTEIN G1L MIT DEM
EKTROMELIEVIRUS STAMM MOSKAU PROTEIN EVM064 132
X. DANKSAGUNG 133
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