Interaktion von Opioiden mit Herceptin in humanen Mammakarzinomzellen:
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2010
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INHALTSVERZEICHNIS 1
INHALTSVERZEICHNIS
I EINLEITUNG 6
II LITERATURUEBERSICHT 8
1. OPIOIDE 8
1.1 DEFINITION UND EINTEILUNG 8
1.2 REZEPTOREN 8
1.3 OPIOIDERGE WIRKMECHANISMEN 9
1.3.1 G-PROTEIN-GEKOPPELTE REZEPTOREN 9
1.3.2 ADENYLYLCYCLASEN 11
1.3.3 MITOGEN-AKTIVIERTE PROTEINKINASEN (MAP-KINASEN) 12
1.4 THERAPIE VON TUMORSCHMERZEN 13
1.5 NEBENWIRKUNGEN DER OPIOIDE 15
2. EGF-REZEPTOREN 15
2.1 DEFINITION 15
2.2 PROTEINSTRUKTUR 16
2.3 EINTEILUNG UND FUNKTION DER EINZELNEN EGF-REZEPTOREN 17
2.4 HER-2 REZEPTOR 17
3. HERCEPTIN (TRASTUZUMAB) 18
3.1 UEBERBLICK 18
3.2 WIRKMECHANISMUS 19
3.3 THERAPIE UND VERABREICHUNG 20
3.4 ZULASSUNG 21
III FRAGESTELLUNG 22
IV MATERIAL UND METHODEN 23
1. MATERIALIEN 23
1.1 GERAETE 23
1.2 VERBRAUCHSGEGENSTAENDE 24
1.3 CHEMIKALIEN 25
1.4 VERWENDETE DNA UND ANTIKOERPER 27
2. METHODEN 27
2.1 ZELLMODELLE 27
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2
2.1.1 ZELLKULTUR 27
2.1.1.1 KULTIVIERUNG DER BT-474, SKBR-3 UND MCF-7 ZELLEN 28
2.1.1.2 KRYOKONSERVIERUNG DER ZELLEN 29
2.1.1.3 AUFTAUEN DER ZELLEN 29
2.1.1.4 ZELLERNTE 29
2.1.2 OPIOID-BEHANDLUNG 30
2.1.3 HERCEPTIN-BEHANDLUNG 30
2.2 BESTIMMUNG VON OPIOIDREZEPTOREN MITTELS RT-PCR UND
RADIOLIGANDEN-BINDUNG 31
2.2.1 REVERSE-TRANSKRIPTASE-POLYMERASE-KETTENREAKTION (RT-PCR) 31
2.2.1.1 RNA-ISOLATION AUS BT-474, SKBR-3 UND MCF-7 ZELLEN 31
2.2.1.2 RT-PCR: TRANSKRIPTION DER MRNA IN CDNA 33
2.2.1.3 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 33
2.2.1.4 AGAROSE GELELEKTROPHORESE 36
2.2.2 RADIOLIGANDEN-BINDUNG 37
2.2.2.1 MEMBRANPRAEPARATION 37
2.2.2.2 PROTEINBESTIMMUNG NACH LOWRY 38
2.2.2.3 BINDUNG MIT 3 H-U69,593 39
2.2.2.4 BESTIMMUNG DER REZEPTORENDICHTE (B MAX ) 40
2.3 BESTIMMUNG DER EFFEKTORENREGULATION 41
2.3.1 ADENYLYLCYCLASEAKTIVITAET 41
2.3.1.1 INTRAZELLULAERE CAMP-AKKUMULATION 42
2.3.1.2 BESTIMMUNG VON CAMP MITTELS ELISA 42
2.3.2 AFFINITAETSREINIGUNG DES HUMANISIERTEN MONOKLONALEN
ANTIKOERPERS HERCEPTIN 45
2.3.3 BESTIMMUNG VON G-PROTEINEN UND MAP-KINASEN MITTELS
WESTERN BLOT 46
2.3.3.1 HERSTELLUNG VON SDS-PROBEN 46
2.3.3.2 HERSTELLUNG VON SDS-POLYACRYLAMIDGELEN 47
2.3.3.3 SDS-GELELEKTROPHORESE 48
2.3.3.4 TRANSFER VON PROTEINEN IM SEMIDRY-BLOT-VERFAHREN 48
2.3.3.5 IMMUNCHEMISCHE PROTEINDETEKTION 50
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3
2.3.3.6 DETEKTION DER PROTEINBANDE MITTELS CHEMILUMINESZENZ 51
2.3.4 KRISTALLVIOLETT-T EST 52
2.4 AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE 53
V ERGEBNISSE 54
1. CHARAKTERISIERUNG VON OPIOIDREZEPTOREN IN BT-474, SKBR-3
UND MCF-7 ZELLEN 54
1.1 NACHWEIS VON OPIOIDREZEPTOREN MITTELS RT-PCR 54
1.1.1 GAPDH (186 BP) 54
1.1.2 P-OPIOIDREZEPTOR (342 BP) 55
1.1.3 OE-OPIOIDREZEPTOR (494 BP) 56
1.1.4 K-OPIOIDREZEPTOR (322 BP) 57
1.2 QUANTIFIZIERUNG VON K-OPIOIDREZEPTOREN IN SKBR-3 UND
MCF-7 ZELLEN 58
1.3 NACHWEIS VON G-PROTEINEN IN SKBR-3 UND MCF-7 ZELLEN 59
1.4 REGULATION DER ADENYLYLCYCLASE IN SKBR-3 UND MCF-7 ZELLEN 60
2. INTERAKTION VON OPIOIDEN MIT HERCEPTININ SKBR-3 UND
MCF-7 ZELLEN 62
2.1 INTERAKTION AUF EBENE DER SIGNALTRANSDUKTION 62
2.1.1 REGULATION DER ERK1/2 IN SKBR-3 UND MCF-7 ZELLEN 62
2.1.2 REGULATION ALTERNATIVER MAP-KINASEN IN SKBR-3 UND MCF-7
ZELLEN 65
2.1.3 REGULATION VON APOPTOSEWEGEN IN SKBR-3 UND MCF-7 ZELLEN 65
2.2 INTERAKTION AUF EBENE DES ZELLWACHSTUMS 67
VI DISKUSSION 71
VII ZUSAMMENFASSUNG 78
VIII SUMMARY 80
IX LITERATURVERZEICHNIS 81
X ANHANG 89
XI DANKSAGUNG 91
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