Die Rolle des Raf Kinase Inhibitor Proteins bei der Differenzierung von Monozyten:
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG S. 1
1. BIOLOGIE DES MAKROPHAGEN S. 1
1.1. DAS MONONUKLEAERE PHAGOZYTENSYSTEM S. 1
1.2. DIE DIFFERENZIERUNG VON MAKROPHAGEN UND DENDRITISCHEN ZELLEN S. 2
1.2.1. DIE ONTOGENESE DER MAKROPHAGEN S. 2
1.2.2. DIE ONTOGENESE DER DENDRITISCHEN ZELLEN S. 5
1.3. HAUPTFUNKTIONEN VON MAKROPHAGEN S. 7
1.4. REIFUNGSABHAENGIGE GENEXPRESSION S. 8
2. DAS RAF KINASE INHIBITOR PROTEIN S. 9
2.1. LABORGESCHICHTLICHER HINTERGRUND S. 9
2.2. DAS RKIP-GEN S. 10
2.3. DIE BIOCHEMISCHE UND STRUKTURELLE NATUR VON RKIP S. 10
2.4. DIE LOKALISATION VON RKIP IN DER ZELLE S. 12
2.5. RKIP-EXPRESSION IN ORGANEN UND GEWEBEN S. 13
2.6. UEBERBLICK UEBER DIE VERSCHIEDENEN FUNKTIONEN VON RKIP S. 13
2.6.1. DIE ROLLE VON RKIP IN DER SIGNALTRANSDUKTION S. 13
2.6.1.1. RKIP IN DER RAF/MEK/ERK-KASKADE S - 1 3
2.6.1.2. RKIP IN DER NFICB-SIGNALKASKADE S. 1 6
A) DER KLASSISCHE WEG DER NFICB-AKTIVIERUNG S. 16
B) DER NON-KANONISCHE WEG DER NFKB-AKTIVIERUNG S. 17
C) WIRKUNGSWEISE VON RKIP AUF DEN NFICB-SIGNALWEG S. 18
2.6.1.3. DIE ROLLE VON RKIP IN WEITEREN SIGNALKASKADEN S. 18
2.6.2. WEITERE RKIP-FUNKTIONEN S. 19
II. ZIEL DER ARBEIT S. 22
III. MATERIAL S. 23
1. GERAETE S. 23
2. VERBRAUCHSMATERIALIEN S. 24
3. REAGENZIEN S. 24
4. STANDARDS UND KITS S. 25
5. ENZYME UND ANTIKOERPER S. 25
V I
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
6. ORGANISMEN S. 26
7. VEKTOREN S. 27
8. SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE S. 27
9. MEDIEN UND PUFFER S. 28
IV. METHODEN S. 30
1. ZELLBIOLOGISCHE METHODEN S. 30
1.1. KULTUR EUKARYONTER ZELLEN S. 30
1.1.1. KULTURBEDINGUNGEN UND PASSAGIEREN S. 30
1.1.2. DIFFERENZIERUNG DER THP-1 HL-60- UND U-937-ZELLEN ZU S. 30
MAKROPHAGEN
1.1.3. ZELLERNTE S. 31
1.1.4. MYKOPLASMENTEST S. 31
1.2. GEWINNUNG UND KULTIVIERUNG PRIMAERER ZELLEN S. 31
1.2.1. GEWINNUNG HUMANER PERIPHERER BLUTMONOZYTEN S. 31
1.2.1.1. MONOZYTENAPHERESE S. 31
1.2.1.2. GEGENSTROMELUTRIATION S. 32
1.2.2. KULTIVIERUNG VON MAKROPHAGEN S. 32
1.2.3. KULTIVIERUNG VON DENDRITISCHEN ZELLEN S. 33
1.2.4. ERNTE DER MAKROPHAGEN UND DENDRITISCHEN ZELLEN S. 33
1.3. TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE S. 33
1.3.1. TRANSIENTE TRANSFEKTION DURCH ELEKTROPORATION S. 33
1.3.2. LUCIFERASE-REPORTERGEN ANALYSEN S. 36
2. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN S. 37
2.1. KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN S. 37
2.1.1. ANLEGEN EINER BAKTERIENFLUESSIGKULTUR S. 37
2.1.2. ANLEGEN EINER BAKTERIENPLATTENKULTUR S. 37
2.1.3. ANLEGEN EINER GLYZERINKULTUR S. 38
2.2. PLASMIDVEKTOREN S. 38
2.2.1. MINIVMAXI-DNA-PRAEPARATION S. 38
2.2.3. TRANSFORMATION VON BAKTERIEN (HITZESCHOCKTRANSFORMATION) S. 39
V I I
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
2.3. PRAEPARATION, ENZYMATISCHE MANIPULATION, ANALYSE UND SEQUENZ- S. 39
IERUNG VON DNA
2.3.1. RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA S. 39
2.3.2. GELELEKTROPHORESE S. 40
2.3.3. ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN DURCH GELEXTRAKTION S. 41
2.3.4. KLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN S. 42
2.3.5. SEQUENZIERUNG VON PLASMID-DNA S. 42
2.4. PRAEPARATION UND ANALYSE VON RNA S. 43
2.4.1. ISOLIERUNG VON RNA S. 44
2.4.2. UV-SPEKTROSKOPIE ZUR KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON S. 45
NUKLEINSAEUREN
2.4.3. UV-SPEKTROSKOPIE ZUR ABSCHAETZUNG DER REINHEIT VON S. 45
NUKLEINSAEUREN
2.4.4. RNA-QUALITAETSKONTROLLE S. 46
2.4.5. RNA-AUTREINIGUNG DURCH DNASE-VERDAU S. 47
2.4.6. REVERSE TRANSKRIPTION S. 48
2.4.7. REAL-TIME RT-PCR-ANALYSEN S. 49
2.4.7.1. DAS ALLGEMEINE PRINZIP DER PCR S. 49
2.4.7.2. QUANTITATIVE REAL-TIME PCR S. 50
2.4.7.2.1. QUANTITATIVE REAL-TIME PCR NACH DEM S. 51
LIGHTCYCLER-PRINZIP
2.4.7.2.2. QUANTITATIVE REAL-TIME RT-PCR NACH DEM S. 53
TAQMAN-PRINZIP
3. IMMUNOLOGISCHE METHODEN S. 55
3.1. DURCHFLUSSZYTOMETRIE S. 55
4. PROTEINCHEMISCHE METHODEN S. 55
4.1. PRAEPARATION VON ZELLKERNEXTRAKTEN DURCH HYPOTONISCHE NONIDET P-40
S. 55
LYSE
4.2. PRAEPARATION VON GESAMTPROTEINEXTRAKTEN S. 56
4.3. PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG MIT BCA S. 56
4.4. ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON PROTEINEN DURCH NUPAGE S. 57
4.5. WESTERN BLOT ANALYSE UND IMMUNOFAERBUNG VON PROTEINEN S. 57
VIII
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
4.6. NFKB-AKTIVIERUNGSASSAY
4.7. GELSHIFT-ASSAYS (EMSA)
4.8. SUPERSHIFT-ASSAYS
S. 58
S. 59
S. 60
V. ERGEBNISSE S. 61
1. ERFASSUNG DES GENOMISCHEN EXPRESSIONSPROFILS HUMANER MONOZYTEN UND S.
61
MAKROPHAGEN MITTELS MIKROARRAYS
2. VALIDIERUNG DER AFFYMETRIX MIKROARRAY DATEN MITTELS LIGHTCYCLER
RT-PCR S. 63
3. VALIDIERUNG DER DNA-MIKROARRAY ERGEBNISSE UND LIGHTCYCLER ERGEBNISSE
S. 65
MITTELS DER QUANTITATIVEN TAQMAN RT-PCR-TECHNOLOGIE
4. VERIFIZIERUNG DER RKIP-INDUKTION WAEHREND DER MAKROPHAGEN- UND S. 67
DENDRITENDIFFERENZIERUNG AUF PROTEINEBENE
5. RKIP-TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE S. 69
5.1. UNTERSUCHUNG DER RKIP-EXPRESSION IN MYELOISCHEN TUMORZELLLINIEN S.
69
5.2. RKIP-TRANSFEKTION IN THP-1 ZELLEN S. 70
5.3. BESTIMMUNG DER MRNA- UND OBERFLAECHENPROTEINEXPRESSION DER S. 72
OBERFLAECHENMARKER CD11 C, CD45 UND CD36 IN RKIP-TRANSFIZIERTEN
THP-1 ZELLEN
6. UNTERSUCHUNG DES RAF/MEK/ERK-SIGNALWEGS MITTELS WESTERN BLOT S. 74
7. UNTERSUCHUNG DER NFSB-AKTIVIERUNG MITTTELS TRANSAM ASSAY S. 75
8. UNTERSUCHUNG DER NFICB-AKTIVIERUNG MIT HILFE VON
GELSHIFT-EXPERIMENTEN S. 76
UND SUPERSHIFT-EXPERIMENTEN
VI. DISKUSSION S. 78
1. KONTINUIERLICHE HOCHREGULATION VON RKIP AUF MRNA-EBENE WAEHREND DER S.
79
MONOZYTEN-MAKROPHAGENDIFFERENZIERUNG
2. KONTINUIERLICHE RKIP-MRNA-LNDUKTION WAEHREND DER DENDRITISCHEN S. 81
ZELLDIFFERENZIERUNG
3. KONTINUIERLICHE RKIP-HOCHREGULATION IN MAKROPHAGEN UND DENDRITISCHEN
S. 83
ZELLEN AUF PROTEINEBENE
4. UNTERSUCHUNG DER ERK- UND PERK-AKTIVITAET WAEHREND DER DENDRITISCHEN
UND S. 84
MAKROPHAGOZYTAEREN ZELLDIFFERENZIERUNG
4.1. EXPRESSIONSZUNAHME DER ERK- UND PERK-PROTEINLEVEL WAEHREND DER S. 84
PHAGOZYTAEREN DIFFERENZIERUNG
I X
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS
4.2. EXPRESSIONSZUNAHME DER ERK- UND PERK-PROTEINLEVEL WAEHREND DER S. 85
DENDRITISCHEN DIFFERENZIERUNG
4.3. ZEITKINETIK DES ERK-ANSTIEGS S. 86
4.4. FOLGERUNGEN DER ERK-AKTIVIERUNG FUER DIE RKIP-FUNKTION WAEHREND DER
S. 86
ZELLDIFFERENZIERUNG
5. DIE RKIP-UEBEREXPRESSION IN TRANSFIZIERTEN THP-1 ZELLEN FUEHRT ZUR
STARKEN S. 87
REDUKTION DER NF^B-UNTEREINHEIT P65
5.1. ANALYSE DER POTENTIELLEN MECHANISMEN DER RKIP-VERMITTELTEN N F K B
- S . 8 9
INHIBITION
6. HOCHREGULATION DER OBERFLAECHENMARKER CD11C, CD45 UND CD36 AUF S. 90
MRNA- UND PROTEINEBENE NACH EKTOPER RKIP-EXPRESSION IN THP-1 ZELLEN
6.1. INTERPRETATION DES CD11C-ANSTIEGS S. 91
6.2. INTERPRETATION DES CD36-ANSTIEGS S. 92
6.3. INTERPRETATION DES CD45-ANSTIEGS S. 94
VII. ZUSAMMENFASSUNG S. 96
VIII. LITERATURVERZEICHNIS S. 97
IX. DANKSAOUNO S . 149
X. PUBLIKATION S. 149
X
|
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