DNA-Schädigung beeinflusst die Regulation der Aktivierungs-induzierten Cytidin-Deaminase:
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2011
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INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS VII
TABELLENVERZEICHNIS VIII
1. ZUSAMMENFASSUNG 1
2. EINLEITUNG 2
2.1 DIE ADAPTIVE IMMUNANTWORT 2
2.1.1 DER B-ZELLREZEPTOR 3
2.1.2 DIE KEIMZENTRUMSREAKTION 4
2.1.2.1 SOMATISCHE HYPERMUTATION 7
2.2 REPARATUR DER AID-INDUZIERTEN DNA-SCHAEDEN 8
2.2.1 ENTSTEHUNG VON B-ZELLLYMPHOMEN 1 1
2.3 REGULATION VON AID 12
2.3.1 TRANSKRIPTIONELLE REGULATION VON AID 13
2.3.2 REGULATION DER AID-AKTIVITAET DURCH MICRORNA 14
2.3.3 POSTTRANSLATIONALE REGULATION VON AID 14
2.3.3.1 DIE SUBZELLULAERE VERTEILUNG VON AID STEUERT DEN AID-ABBAU 15
2.4 DAS UBIQUITIN-PROTEASOM-SYSTEM (UPS) 17
2.5 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 19
3. ERGEBNISSE 2 1
3.1 ANALYSE VERSCHIEDENER AID-GFP FUSIONSPROTEINE IN ZWEI ZELLLINIEN 2 1
3.1.1 EXPRESSION UND FUNKTION DER VIER AID-GFP FUSIONSPROTEINE 22
3.1.2 SPEZIFISCHER AID-ABBAU IM ZELLKERN 24
3.2 ANALYSE DER AKTIVITAET, DER LOKALISATION UND DES ABBAUS VON AID-GFP
MUTANTEN. 28 3.2.1 UNTERSUCHUNG DER EXPRESSION UND FUNKTION DER
AID-MUTANTEN 30
3.2.2 UNTERSUCHUNG DER LOKALISATION UND DEGRADATION DER AID-MUTANTEN 32
3.3 AID-GFP PROTEINSTABILITAET BEI EXOGEN INDUZIERTEN DNA-LAESIONEN 34
3.3.1 PROTEINSTABILITAET DER AID-GFP MUTANTEN BEI EXOGEN INDUZIERTEN
DNA-LAESIONEN 40
3.4 PROTEINLOKALISATION DES ENDOGENEN AID BEI EXOGEN INDUZIERTEN
DNA-LAESIONEN... 43
3.5 AID-ANREICHERUNG AN DNA-LAESIONSSTELLEN IM ZELLKERN VON HELA-ZELLEN
45
3.6 AID-UBIQUITINIERUNG BEI DNA-LAESIONEN 49
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IMAGE 2
4. DISKUSSION 50
4.1 VERGLEICHENDE ANALYSE VERSCHIEDENER AID-GFP KONSTRUKTE 50
4.1.1 LOKALISATION UND EXPRESSION DER AID-GFP FUSIONSPROTEINE 5 1
4.1.2 FUNKTION UND DEGRADATION DER AID-GFP FUSIONSPROTEINE 52
4.2 DER PROTEASOMALE ABBAU VON AID WIRD VON SEINER AKTIVITAET BEEINFLUSST
53 4.2.1 EXPRESSION UND ABBAUVERHALTEN VERSCHIEDENER AID-MUTANTEN 53
4.3 DIE BER-AKTIVIERENDEN SUBSTANZEN MMS UND H 2 0 2 STOEREN DEN
AID-ABBAU 54
4.4 ARBEITSHYPOTHESE: DER NUKLEAERE AID-ABBAU WIRD BEI BER-INDUZIERENDEN
DNA-SCHAEDEN GEHEMMT 56
4.4.1 AID-CHROMATINBINDUNG ALS MOEGLICHE URSACHE F UE R ABBAUHEMMUNG 57
4.4.2 SIGNAL-VERMITTELTE STOERUNG DER UBIQUITINIERUNG ALS MOEGLICHE
URSACHE FUER ABBAUHEMMUNG 60
4.5 AUSBLICK 62
5 MATERIAL UND METHODEN 64
5.1 MATERIAL 64
5.1.1 CHEMIKALIEN 64
5.1.2 GERAETE 64
5.1.3 VERWENDETE KITS 65
5.1.4 DATENVERARBEITUNG 65
5.1.5 GROESSENMARKER 65
5.1.5.1 DNA-GROESSENSTANDARD 65
5.1.5.2 PROTEIN-GROESSENSTANDARD 65
5.1.6 PLASMIDE 66
5.1.7 BAKTERIEN 66
5.1.8 ZELLLINIEN 66
5.1.9 ANTIKOERPER 66
5.1.10 OLIGONUKLEOTIDE 67
5.1.11 ENZYME 67
5.2 ZELLKULTUR 67
5.2.1 BESTIMMUNG DER ZELLDICHTE 68
5.2.2 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN 69
5.2.3 ZELLKULTURBEDINGUNGEN 69
5.2.4 STABILE TRANSFEKTION VON SUSPENSIONSZELLEN 69
5.2.5 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON ADHAERENTEN ZELLEN 69
5.2.6 BESTIMMUNG DER HYPERMUTATIONSAKTIVITAET IM FACS 70
5.3 TECHNIKEN DER DNA-ANALYSE 7 1
5.3.1 MINI-PRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN 7 1
5.3.2 MAXI-PRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN 7 1
5.3.3 DNA-QUANTIFIZIERUNG 7 1
5.3.4 DNA-GELELEKTROPHORESE 7 1
5.3.5 POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR) 72
IMAGE 3
5.3.6 DNA-MUTAGENESE 72
5.3.7 DNA-SEQUENZIERUNG UND DATENAUSWERTUNG 72
5.4 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 73
5.4.1 PRAEPARATION VON PROTEINEN AUS ZELLEN 73
5.4.2 PROTEINQUANTIFIZIERUNG 73
5.4.3 SDS-PA-GELELEKTROPHORESE NACH LAEMMLI (1970) 74
5.4.4 WESTERN BLOT 74
5.4.5 SPEZIFISCHER PROTEINNACHWEIS MITTELS ANTIKOERPER 75
5.4.6 FRAKTIONIERUNG 76
5.4.7 IMMUNPRAEZIPITATIONSASSAY 76
5.5 ABBAUKINETIK IM FACS 77
5.5.1 BEHANDLUNG DER ZELLEN 77
5.5.2 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSE 77
5.6 MIKROSKOPISCHE METHODEN 78
5.6.1 KONFOKALE MIKROSKOPIE DER FIXIERTEN SUSPENSIONSZELLEN 78
5.6.1.1 IMMOBILISIERUNG DER SUSPENSIONSZELLEN 78
5.6.1.2 PARAFORMALDEHYD-FIXIERUNG 78
5.6.1.3 MIKROSKOPISCHE ANALYSE 78
5.6.2 LEBENDZELLMIKROSKOPIE DER ADHAERENTEN ZELLEN NACH UV-BESTRAHLUNG 79
5.6.2.1 KONFOKALE LEBENDZELLAUFNAHME 79
5.6.2.2 DATENAUSWERTUNG 79
6 LITERATUR 80
7 ANHANG 90
7.1 ABKUERZUNGEN 90
7.2 DANKSAGUNG 94
7.3 EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG 95
7.4 ERKLAERUNG 96
7.5 LEBENSLAUF 97
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