Gezielter Wirkstofftransport und nicht-viraler Gentransfer mittels fokussiertem Ultraschall: ein neuer Therapieansatz
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS IV
TABELLENVERZEICHNIS VI
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS VII
1 EINLEITUNG 1
1.1 ULTRASCHALL ]
1.1.1 ALLGEMEINE GRUNDLAGEN 1
1.1.2 DIAGNOSTISCHER ULTRASCHALL 3
1.1.3 THERAPEUTISCHER ULTRASCHALL 4
1.2 MICROBUBBLES 5
1.2.1 LIPID-MICROBUBBLES 8
1.2.2 POLYMER- U N D PROTEINBASIERTE-MICROBUBBLES 8
1.2.3 THERAPEUTISCHE MICROBUBBLES 9
1.3 US U N D MICROBUBBLE VERMITTELTER WIRKSTOFFTRANSPORT 11
1.4 GENTHERAPIE 14
1.4.1 VIRALER GENTRANSFER 14
1.4.2 NICHT-VIRALER GENTRANSFER 16
1.4.3 US U N D MICROBUBBLE VERMITTELTER GENTRANSFER 18
1.5 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 20
2 MATERIALIEN UND M E T H O D E N 2 1
2.1 MATERIALIEN 21
2.1.1 GERAETE U N D SOFTWARE 21
2.1.2 CHEMIKALIEN 22
2.1.3 MARKER, ENZYME U N D FLUORESZENZFARBSTOFF 23
2.1.4 REAGENZIENSYSTEME U N D KITS 23
2.1.5 ANTIKOERPER 24
2.2 PUFFER. LOESUNGEN U N D MEDIEN 24
2.2.1 MEDIEN U N D LOESUNGEN FUER ARBEITEN M I T H U M A N E N U-87 M G
ZELLEN . . . . 24
2.2.2 ALLGEMEINE MEDIEN FUER ARBEITEN M I T BAKTERIEN 24
2.2.3 PUFFER U N D LOESUNGEN FUER MOLEKULARBIOLOGISCHES U N D
BIOCHEMISCHES ARBEITEN 24
2.2.4 LOESUNGEN FUER X-GAL FAERBUNGEN 25
2.3 MICROBUBBLES 25
2.4 VERWENDETE REPORTERMOLEKUELE, CARRIERSYSTEME, CHEMOTHERAPEUTIKA U N D
PLASMIDE 26
2.4.1 FITC-DEXTRAN 26
2.4.2 NANOPARTIKEL AUS H U M A N E M SERUMALBUMIN 27
2.4.3 LIPOSOMALES DOXORUBICIN 28
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS II
2.4.4 PLASMIDE 29
2.5 METHODEN 30
2.5.1 KULTIVIERUNG VON ESCHERICHIA COLI (E. COLI ) 30
2.5.2 BAKTERIENGLYCERINSTOCKS 30
2.5.3 PLASMIDTRANSFORMATION IN CHEMISCH-KOMPETENTE E. COLI- ZELLEN 30
2.5.4 PLASMID-DNA ISOLIERUNG AUS E. COLI 3 1
2.5.5 RESTRIKTIONSVERDAU U N D AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 31
2.5.6 PLASMID-DNA ISOLIERUNG AUS B L U T 31
2.5.7 KULTIVIERUNG VON U-87 M G GLIOBLASTOMZELLEN 32
2.5.8 TRANSFEKTION VON U-87 M G ZELLEN MITTELS
CALCIUMPHOSPLIAT-PRAEZIPITATION 32
2.5.9 TIERMODELLE 33
2.5.10 U-87 M G TUMORXENOGRAFTS 33
2.5.11 US-TUMORVOLUMENBESTIMMUNG 33
2.5.12 KONTRASTMITTEL-VERSTAERKTER US ZUR PERFUSIONSANALYSE 34
2.5.13 FUS M I T D E M THERAPEUTIC AND IMAGING PROBE SYSTEM, (TIPS) 34
2.5.14 FUS-ANWENDUNG IN VITRO 35
2.5.15 FUS-ANWENDUNG IN VIVO 37
2.5.16 FUS UNTER VERWENDUNG EINES EINZELELEMENT-TRANSDUCERS 47
2.5.17 QUANTIFIZIERUNG VON F I T C - D E X T R A N POSITIVEN ZELLEN I N
VITRO 48
2.5.18 DURCHFLUSSZYTOMETRIE ZUR BESTIMMUNG DER ZELLVIABILTAET 48
2.5.19 QUANTIFIZIERUNG F I T C - D E X T R A N POSITIVER U-87 M G ZELLEN
IN VIVO 49
2.5.20 OPTISCHE FLUORESZENZ- U N D BIOLUMINESZENZBILDGEBUNG 49
2.5.21 E I N B E T T U N G VON GEWEBE IN PARAFFIN 55
2.5.22 4 : .6-DIAMIDIN-2-PHENYLINDOL (DAPI) F AE R B U N G 55
2.5.23 TDT-VERMITTELTES D U T P - X NICK-END-LABELING (TUNEL) 55
2.5.24 HAEMATOXYLIN-EOSIN F AE R B U N G 55
2.5.25 GIEMSA F AE R B U N G 56
2.5.26 X-GAL F AE R B U N G VON ORGANEN 57
2.5.27 X-GAL F AE R B U N G VON KRVOSCHNITTEN 57
2.5.28 IMMUNHISTOLOGISCHER /3-GALACTOSIDASE NACHWEIS 58
2.5.29 STATISTIK 58
3 ERGEBNISSE 5 9
3.1 I N VITRO ERGEBNISSE DER FUS U N D MICROBUBBLE VERMITTELTEN AUFNAHME
DES REPOR
TERMOLEKUELS FITC-DEXTRAN I M ZELLKULTURMODELL 59
3.1.1 VORVERSUCHE ZUR E R M I T T L U N G MINIMALER U N D MAXIMALER
FUS-PULSLAENGEN FUER
EINE FUS U N D MICROBUBBLE VERMITTELTE F I T C - D E X T R A N AUFNAHME
I N VITRO . 59
3.1.2 FUS VERMITTELTE AUFNAHME VON F I T C - D E X T R A N IN U-87 M G
ZELLEN I N VITRO 59
3.1.3 ZELLVIABILITAET DER U-87 M G ZELLEN NACH FUS-BEHANDLUNG I N VITRO
61
3.2 I N VIVO ERGEBNISSE DER FUS U N D MICROBUBBLE VERMITTELTEN AUFNAHME
VON F I T C - DEXTRAN IN EINEM U-87 M G GLIOBLASTOM TUMORXENOGRAFTMODELL
62
3.2.1 U-87 M G GLIOBLASTOM TUMORMODELL 62
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS II]
3.2.2 FUS U N D MICROBUBBLE VERMITTELTE AUFNAHME VON F I T C - D E X T R
A N DURCH U- 87 M G TUMORZELLEN I N VIVO 64
3.3 FUS U N D MICROBUBBLE VERMITTELTE AUFNAHME VON 140 11111 N A N O P A
R T I K E L N IN TUMOR
GEWEBE I N VIVO 69
3.3.1 I N VITRO CHARAKTERISIERUNG DER HSA-NANOPARTIKEL MITTELS OPTISCHER
BILDGEBUNG 69
3.3.2 I N VIVO CHARAKTERISIERUNG DER HSA-NANOPARTIKEL MITTELS OPTISCHER
BILDGEBUNG 69
3.3.3 ERGEBNISSE DER FUS U N D MICROBUBBLE VERMITTELTEN AUFNAHME DER
HSANANOPARTIKEL IM U-87 M G TUMORMODELL 78
3.3.4 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE DER FUS U N D MICROBUBBLE
VERMITTELTEN
AUFNAHME VON HSA-NANOPARTIKELN I M TUMORMODELL I N VIVO 80
3.4 ANWENDUNG VON FUS IN DER CHEMOTHERAPIE VON U-87 M G TUMOREN 81
3.4.1 SENSITIVITAET VON U-87 M G TUMOREN GEGENUEBER CAELYX 81
3.4.2 ERGEBNISSE ZUR UNTERSUCHUNG EINER ERHOEHUNG DER WIRKSAMKEIT VON
CAELYX DURCH FUS 82
3.4.3 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE DER ANWENDUNG VON FUS IN DER CHEMO
THERAPIE VON U-87 M G TUMOREN 83
3.5 NICHT-VIRALER GENTRANSFER MITTELS FUS 84
3.5.1 NICHT-VIRALER GENTRANSFER DES REPORTERPLAMIDS PCDNA3.1 HIS FLACZ
IN DAS
MYOKARD VON MAUS U N D R A T T E MITTELS FUS 84
3.5.2 NICHT-VIRALER GENTRANSFER MITTELS US UNTER VERWENDUNG EINES
EINZELELEMENT-TRANSDUCERS 90
4 DISKUSSION 9 3
4.1 DIE KOMBINATION AUS FUS U N D MICROBUBBLE VERBESSERT I N VITRO DIE
AUFNAHME DES
REPORTERMOLEKUELS FITC-DEXTRAN UNTER DER VERWENDUNG LANGER FUS-PULSE 93
4.2 DIE ANWENDUNG VON FUS U N D MICROBUBBLES FUER EINEN GEZIELTEN
TRANSPORT VON
FITC-DEXTRAN IM I N VIVO TUMORMODELL U N D DIE ZU G R U N D E LIEGENDEN
MECHANISMEN
FUER EINEN ERFOLGREICHEN THERAPIEANSATZ 96
4.3 CHARAKTERISIERUNG DER HSA-NANOPARTIKEL I N VIVO MITTELS OPTISCHER
FLUORESZENZBILDGEBUNG U N D DEREN GEZIELTE FUS U N D MICROBUBBLE
VERMITTELTEN AUFNAHME I M I N
VIVO TUMORMODELL 101
4.4 FUS KANN DIE THERAPEUTISCHE WIRKSAMKEIT VON CAELYX NICHT VERBESSERN
106
4.5 DER NICHT-VIRALER GENTRANSFER VON P D N A DURCH FUS U N D
MICROBUBBLES M I T D E M
T I P S IN D A S MYOKARD IST N U R IN MAEUSEN BEDINGT ERFOLGREICH 108
4.6 DER NICHT-VIRALE GENTRANSFER UNTER VERWENDUNG EINES
EINZELELEMENT-USTRANSDUCERS IST ABHAENGIG VON DER INJIZIERTEN DOSIS DER
MICROBUBBLES 110
5 Z U S A M M E N F A S S U N G UND AUSBLICK 1 1 3
6 LITERATURVERZEICHNIS 1 1 6
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