Funktion von IRAG für cGMP-Kinase-I-Komplexe sowie für die InsP3R-I-Phosphorylierung:
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2011
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS 1
A. EINLEITUNG 1
A.1 DER NO/CGMP/CGKI-SIGNALWEG 1
A.1.1 NO- UND CGMP-BILDUNG 1
A.1.2 PHARMAKOLOGISCHE EINGRIFFSMOEGLICHKEITEN 3
A.1.3 DIE CGMP-ABHAENGIGEN PROTEINKINASEN 4
A.1.4 DERTRIMERE SIGNALKOMPLEX 6
A.1.4.1 IDENTIFIKATION DES TRIMEREN MAKROKOMPLEXES 6
A.1.4.2 DIE INOSITOLTRISPHOSPHAT-REZEPTOREN 7
A.1.4.3 FUNKTION DES TRIMEREN KOMPLEXES 9
A.1.5 PHYSIOLOGISCHE FUNKTIONEN VON IFRAG 10
A.1.5.1 FUNKTION VON IRAG IN THROMBOZYTEN 10
A.1.5.2 FUNKTION VON IRAG IN DER GLATTEN MUSKULATUR 11
A.1.6 WEITERE CGKL-SUBSTRATE UND IHRE FUNKTION 12
A.2 UNTERSUCHUNG VON INTERAKTIONEN ZWISCHEN PROTEINEN 15
A.3 ZIELE DER ARBEIT 17
B. MATERIAL UND METHODEN 18
B.1 MATERIALIEN 18
B.1.1 GERAETE 18
B.1.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN UND KITS 19
B.1.3 CHEMIKALIEN UND ARZNEISTOFFE 20
B.1.4 VERWENDETE ANTIKOERPER 22
B.1.5 PUFFER UND LOESUNGEN 22
B.1.6 GELE FUER SDS-PAGE UND TRICIN-SDS-PAGE 23
B.1.7 VERWENDETE OLIGONUKLEOTIDE 24
B.2 METHODEN 24
B.2.1 VERSUCHSTIERE 24
B.2.2 ALLGEMEINE PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 25
B.2.2.1 GEWINNUNG VON PROTEIN AUS MAUSGEWEBEN 25
B.2.2.2 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 26
B.2.2.3 PROTEINBESTIMMUNG NACHJ-OWRY 26
B.2.2.4 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 27
B.2.2.5 COOMASSIE-FAERBUNG 27
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
B.2.2.6 WESTERN BLOT 28
B.2.2.7 ANTIKOERPERENTFERNUNG ( STRIPPEN ) ZUR WIEDERVERWENDUNG DER
WESTERN BLOTS 29
B.2.3 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 30
B.2.3.1 CO-IMMUNPRAEZIPITATION 30
B.2.3.2 CGMP-, CAMP- UND HEPARIN-AGAROSE 31
B.2.4 PHOSPHORYLIERUNGSEXPERIMENTE 32
B.2.4.1 ISOLIERUNG VON THROMBOZYTEN AUS MAUSBLUT 32
B.2.4.2 STIMULATION VON THROMBOZYTEN 33
B.2.4.3 DETEKTION DER PROTEINPHOSPHORYLIERUNG MIT HILFE VON
PHOSPHOANTIKOERPERN 33
B.2.4.4 DENSITOMETRIE UND BERECHNUNG DER ZUNAHME DER PHOSPHORYLIERUNG 34
B.2.4.5 /N-WVO-PHOSPHORYLIERUNG MIT 33 P-H 3 P0 4 UND AUTORADIOGRAPHIE
36
B.2.4.6 ISOLIERUNG VON THROMBOZYTEN AUS HUMANBLUT 39
B.2.4.7 AUFSCHLUSS UND PHOSPHORYLIERUNG VON AORTENGEWEBE 39
B.2.5 MESSUNG DER THROMBOZYTENAGGREGATION 40
B.2.5.1 ISOLIERUNG VON THROMBOZYTEN 40
B.2.5.2 MESSUNG DER THROMBOZYTENAGGREGATION MIT DEM LUMINOAGGREGOMETER
40
B.2.5.3 AUSWERTUNG UND STATISTIK 41
B.2.6 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 41
B.2.6.1 RNA-ISOLIERUNG AUS THROMBOZYTEN 41
B.2.6.2 RT-PCR 42
B.2.6.3 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 42
B.2.6.4 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 43
B.2.6.5 GENERIERUNG VON IRAGALNT IN PCDNA3.1(-) 44
B.2.6.6 PCRS ZUR GENERIERUNG DER IRAGALNT-CDNA 45
B.2.6.7 GELEXTRAKTION 46
B.2.6.8 DNA-SPALTUNG MIT RESTRIKTIONSENZYMEN 46
B.2.6.9 LIGATION 47
B.2.6.10 HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIENZELLEN FUER DIE TRANSFORMATION
48
B.2.6.11 TRANSFORMATION 49
B.2.6.12 MINIPREP, MAXIPREP UND SEQUENZIERUNG 50
B.2.6.13 TRANSFEKTION VON COS-7-ZELLEN FUER DIE INTERAKTIONSVERSUCHE 50
B.2.6.14 TRANSFEKTION UND IMMUNZYTOCHEMIE VON COS-7-ZELLEN 52
B.2.6.15 MIKROSKOPIE 54
B.2.7 STATISTIK 54
C. ERGEBNISSE 55
C.1 UNTERSUCHUNG DER FUNKTION DER LNSP3R-L-PHOSPHORYLIERUNG 55 C.1.1
UNTERSUCHUNG DER LNSP 3 R-L-PHOSPHORYLIERUNG IN MURINEN THROMBOZYTEN 55
C.1.1.1 NACHWEIS DES TRIMEREN MAKROKOMPLEXES IN THROMBOZYTEN 55
C.1.1.2 DIE LNSP 3 R-L-SPLEISSVARIANTEN IN THROMBOZYTEN 59
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
C.1.1.3 /N-V/VO-PHOSPHORYLIERUNG DES LNSP 3 R-L IN THROMBOZYTEN 61
33
C.1.1.4 BESTIMMUNG DER PHOSPHORYLIERUNG DES LNSP 3 R-L MITTELS
P-MARKIERUNG UND
AUTORADIOGRAPHIE 71
C.1.2 CGMP-STIMULIERTE HEMMUNG DER THROMBOZYTENAGGREGATION 73
C.1.3 PHOSPHORYLIERUNG DES LNSP 3 R-L IN HUMANEN THROMBOZYTEN UND IN
MURINEM
AORTENLYSAT 75
C.1.4 STIMULATION DER PKA IN THROMBOZYTEN 77
C.1.4.1 STIMULATION MITCBIMPS, FORSKOLIN UND LLOPROST 77
C.1.4.2 IDENTIFIKATION EINES DURCH DIE PKA PHOSPHORYLIERTEN, MIT DEM
ANTI-P-LNSP 3 R-L-AK
(SER1755) DETEKTIERTEN UNBEKANNTEN PROTEINS 81
C.2 UNTERSUCHUNG DER IRAG-CGKISS-INTERAKTION IN COS-7-ZELLEN 86
C.2.1 UNTERSUCHUNG DER INTERAKTION ZWISCHEN IRAGALNT UND CGKISS MIT HILFE
VON
CGMP-AGAROSEFAELLUNGEN 86
C.2.2 UNTERSUCHUNG DER LOKALISATION HETEROLOG EXPRIMIERTER CGKISS IN
COS-7-ZELLEN
NACH STIMULATION MIT CGMP 87
C.3 WEITERE CGKI-KOMPLEXE IN THROMBOZYTEN UND IN GLATTMUSKELGEWEBE
VON WT- UND IRAG-KO-MAEUSEN 89
C.3.1 UNTERSUCHUNG DER INTERAKTION ZWISCHEN LNSP 3 R-LL BZW. LNSP 3
R-LLL UND IRAG IN
THROMBOZYTEN UND COLONGEWEBE 89
C.3.1.1 INTERAKTION ZWISCHEN LNSP 3 R-LL UND IRAG 89
C.3.1.2 UNTERSUCHUNG DER INTERAKTION ZWISCHEN IRAG UND LNSP 3 R-LLL IN
THROMBOZYTEN UND
COLONGEWEBE 90
C.3.2 UNTERSUCHUNG DER INTERAKTION ZWISCHEN DERCGKI UND PHOSPHOLAMBAN IN
MURINEN THROMBOZYTEN UND COLONGEWEBE 94
C.3.3 IST DIE PDE5 EIN BESTANDTEIL DES TRIMEREN MAKROKOMPLEXES IN
THROMBOZYTEN
UND COLONGEWEBE? 98
C.3.4 UNTERSUCHUNG DER INTERAKTION ZWISCHEN MYPT-1 UND CGKIA IN DER
GLATTEN
MUSKULATUR VON UTERUS UND COLON 102
D. DISKUSSION 106
D.1 DIE BEDEUTUNG DER CGMP-ABHAENGIGEN LNSP 3 R-L-PHOSPHORYLIERUNG... 106
D.2 DIE TRIMEREN CGKISS/IRAG/LNSPSR-KOMPLEXE 110
D.3 WEITERE CG-KINASE-KOMPLEXE IN THROMBOZYTEN UND
GLATTMUSKELGEWEBE 113
E. ZUSAMMENFASSUNG 119
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
F. LITERATURVERZEICHNIS 121
F.1 ZITIERTE VEROEFFENTLICHUNGEN 121
F.2 EIGENE VEROEFFENTLICHUNGEN 130
F.2.1 POSTER 130
F.2.2 VORTRAEGE 130
F.2.3 ORIGINALARBEITEN 130
G. ANHANG 131
G.1 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 131
G.2 TABELLENVERZEICHNIS 133
G.3 DANKSAGUNG 134
G.4 EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG 135
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| spelling | Salb, Katharina Verfasser aut Funktion von IRAG für cGMP-Kinase-I-Komplexe sowie für die InsP3R-I-Phosphorylierung vorgelegt von Katharina Salb 2011 III, 135 Bl. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Regensburg, Univ., Diss., 2011 Phosphorylierung (DE-588)4174459-7 gnd rswk-swf Inositphosphate (DE-588)4245553-4 gnd rswk-swf Rezeptor (DE-588)4049722-7 gnd rswk-swf Enzymsubstrat (DE-588)4311292-4 gnd rswk-swf Proteinkinasen (DE-588)4175996-5 gnd rswk-swf Cyclo-GMP (DE-588)4318174-0 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Cyclo-GMP (DE-588)4318174-0 s Proteinkinasen (DE-588)4175996-5 s Enzymsubstrat (DE-588)4311292-4 s DE-604 Inositphosphate (DE-588)4245553-4 s Rezeptor (DE-588)4049722-7 s Phosphorylierung (DE-588)4174459-7 s Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:bvb:355-epub-228609 http://epub.uni-regensburg.de/22860/ Verlag kostenfrei Volltext https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:355-epub-228609 Resolving-System DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=025221111&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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