Tenazität von hochpathogenen Erregern in Lebensmitteln und Schnellmethoden zu deren Nachweis am Beispiel Brucella:
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 DIE GATTUNG BRUCELLA 1
1.1.1 TAXONOMIE 3
1.1.2 EPIDEMIOLOGIE 6
1.1.3 PATHOGENITAET 8
1.1.4 KLINIK UND THERAPIE 10
1.2 BRUCELLEN ALS B-WAFFE 12
1.3 DIAGNOSTIK VON BRUCELLEN 13
1.3.1 DIREKTER NACHWEIS 13
1.3.1.1 KULTURELLER NACHWEIS 13
1.3.1.2 MOLEKULARBIOLOGISCHER NACHWEIS 15
1.3.1.3 IMMUNOMAGNETISCHE SEPARATION 22
1.3.1.3.1 HERSTELLUNG, EIGENSCHAFTEN UND VERWENDUNG MAGNETISCHER
PARTIKEL 23
1.3.1.3.2 NACHWEIS VON IMMOBILISIERTEN MIKROORGANISMEN 25
1.3.2 INDIREKTER NACHWEIS 26
1.4 TENAZITAET VON BRUCELLA IN LEBENSMITTELN 29
1.4.1 WASSER 30
1.4.2 MILCH 31
1.4.3 JOGHURT 31
1.4.4 KAESE 32
1.4.5 ANDERE LEBENSMITTEL 32
2 ZIELSETZUNG 33
3 MATERIAL 35
3.1 CHEMIKALIEN UND PUFFER 35
3.2 ENZYME, SEREN UND ANTIKOERPER 36
3.3 PRIMER, SONDEN UND MARKER 37
3.4 BAKTERIENSTAEMME 37
3.5 NAEHRMEDIEN 38
3.6 VERBRAUCHSMATERIALIEN, KITS UND GERAETE 39
3.7 SOFTWARE 40
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IMAGE 2
4 METHODEN / 41
4.1 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 41
4.1.1 TENAZITAET VON BRUCELLEN IN LEBENSMITTELN 41
4.1.1.1 UNTERSUCHTE LEBENSMITTEL 41
4.1.1.2 KULTIVIERUNG DER BRUCELLA- STAEMME 42
4.1.1.3 SPIKEN DER LEBENSMITTELPROBEN MIT BRUCELLEN 43
4.1.1.4 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL IN KONTAMINIERTEN LEBENSMITTELPROBEN 43
4.1.1.5 BESTIMMUNG DER WACHSTUMS- UND REDUKTIONSRATEN 44
4.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 45
4.2.1 EXTRAKTION DER BRUCELLA- DNA AUS DEN LEBENSMITTELPROBEN 45
4.2.1.1 DNA-EXTRAKTION AUS FLUESSIGEN MATRIZES 45
4.2.1.2 DNA-EXTRAKTION AUS FESTEN MATRIZES 47
4.2.1.3 PROTOKOLLE ZU DEN EINGESETZTEN METHODEN DER DNA-EXTRAKTION 47
4.2.1.3.1 DNA-EXTRAKTION MITTELS LYSEPUFFER 47
4.2.1.3.2 DNA-EXTRAKTION MITTELS LYSEPUFFER UND MECHANISCHEN
AUFSCHLUSSES 4 8
4.2.1.3.3 DNA-EXTRAKTION MITTELS LYSEPUFFER UND DNA-BINDENDER SAEULEN 49
4.2.2 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 50
4.2.3 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 51
4.2.4 REAL-TIME PCR 51
4.3 IMMUNOMAGNETISCHE SEPARATION VON BRUCELLEN 52
4.3.1 BESCHICHTUNG DER MAGNETISCHEN PARTIKEL 52
4.3.2 SENSITIVITAET DER IMMUNOMAGNETISCHEN SEPARATION 53
4.3.3 PROTOKOLL ZUR IMMUNOMAGNETISCHEN SEPARATION 53
4.3.4 WIEDERFINDUNGSRATE UND SPEZIFITAET 55
4.3.5 NACHWEIS VON BRUCELLEN IN LEBENSMITTELPROBEN 55
5 ERGEBNISSE 57
5.1 TENAZITAET VON BRUCELLEN IN LEBENSMITTELN 57
5.1.1 TENAZITAET VON BRUCELLEN IN MILCH 57
5.1.2 TENAZITAET VON BRUCELLEN IN JOGHURT 63
5.1.3 TENAZITAET VON BRUCELLEN IN STILLEM MINERALWASSER 65
5.2 EXTRAKTION VON BRUCELLA- DNA AUS LEBENSMITTELN 67
5.2.1 VERGLEICH VON TESTS ZUR EXTRAKTION VON BRUCELLA- DNA AUS ROHMILCH,
JOGHURT, STILLEM MINERALWASSER UND PHYSIOLOGISCHER KOCHSALZLOESUNG 67
IMAGE 3
5.2.1.1 ROHMILCH 69
5.2.1.2 JOGHURT 69
5.2.1.3 STILLES MINERALWASSER 69
5.2.1.4 PHYSIOLOGISCHE KOCHSALZLOESUNG 70
5.2.2 NACHWEISGRENZEN DER AUSGEWAEHLTEN TESTS ZUR EXTRAKTION VON DNA AUS
BRUCELLEN IN ROHMILCH, JOGHURT, STILLEM MINERALWASSER, PHYSIOLOGISCHER
KOCHSALZLOESUNG SOWIE IN CAMEMBERT UND ZIEGENFRISCHKAESE 70
5.3 NACHWEIS VON BRUCELLA- DNA MITTELS REAL-TIME PCR 73
5.4 IMMUNOMAGNETISCHE SEPARATION 78
5.4.1 BESTIMMUNG DER SERUM- BZW. DER ANTIKOERPER-VERDUENNUNG 7 8
5.4.2 SENSITIVITAET DER IMMUNOMAGNETISCHEN SEPARATION 79
5.4.3 WIEDERFINDUNGSRATE UND SPEZIFITAET 81
5.4.4 NACHWEIS VON BRUCELLEN IN LEBENSMITTELPROBEN 84
6 DISKUSSION 86
6.1 TENAZITAET VON BRUCELLEN IN LEBENSMITTELN 86
6.1.1 BEGRUENDUNG DER GEWAEHLTEN VERSUCHS-PARAMETER 86
6.1.2 TENAZITAET IN MILCH 88
6.1.3 TENAZITAET IN JOGHURT 91
6.1.4 TENAZITAET IN STILLEM MINERALWASSER 92
6.2 EXTRAKTION VON BRUCELLA- DNA AUS LEBENSMITTELN UND NACHWEIS MITTELS
PCR 94
6.2.1 BEGRUENDUNG DER GEWAEHLTEN ZELLDICHTEN 94
6.2.2 WAHL DER PCR 95
6.2.3 VERGLEICH DER SENSITIVITAET DER CSP3/-REAL-TIME PCR MIT DER BCSP31
PCR 102
6.3 IMMUNOMAGNETISCHE SEPARATION 107
6.3.1 WAHL DER MAGNETISCHEN PARTIKEL, DER FUER DIE BESCHICHTUNG
VERWENDETEN ANTIKOERPER SOWIE DER ANTIKOERPERVERDUENNUNGEN 107
6.3.2 SENSITIVITAET DER IMMUNOMAGNETISCHEN SEPARATION 109
6.3.3 WIEDERFINDUNGSRATE UND SPEZIFITAET 112
6.3.4 NACHWEIS VON BRUCELLEN AUS LEBENSMITTELN 115
7 ZUSAMMENFASSUNG 118
8 SUMMARY 120
9 ANHANG 122
IMAGE 4
9.1 ERKLAERUNG 122
9.2 PUBLIKATIONEN 123
9.3 DATENTABELLEN 124
9.3.1 TABELLEN MIT REAL-TIME PCR-ERGEBNISSEN ZUR DNA-EXTRAKTION 124
9.3.2 TABELLEN ZUR IMMUNOMAGNETISCHEN SEPARATION 129
9.4 MARKER FUER DIE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 130
9.5 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 131
9.6 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 132
9.7 TABELLEN VERZEICHNIS 134
10 LITERATURVERZEICHNIS 136
11 DANKSAGUNG 155
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