Proliferations- und Differenzierungsverhalten humaner mesenchymaler Stammzellen unter Exposition von Abriebpartikeln der Legierung Tivanium: eine In-vitro-Studie
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN S
2.1 ZELLULAERE GRUNDLAGEN, KNOCHENBIOLOGIE UND -PHYSIOLOGIE 5 2.1.1
STAMMZELLEN, HAEMATOPOESE UND MESENGENESE 5
2 . 1 . 2 OSTEOPOESE UND OSTEOGENESE 1 0
2.1.2.1 DIE OSTEOPOESE 10
2.1.2.2 DIE OSTEOGENESE 13
2.1.2.3 OSTEOGENESE UND OSTEOPOESE IN VITRO 14
2.1.2.3.1 KOLLAGEN TYP I 15
2.1.2.3.2 ALKALISCHE PHOSPHATASE 16
2.1.2.3.3 OSTEOPONTIN (SPP, BSP-I) 17
2.1.2.3.4 OSTEOCALCIN (OCN), BONE GLA PROTEIN (BGP), BSP-I 18
2.1.3 OSTEOKLASTOGENESE 19
2.1.4 SIGNALTRANSDUKTIONSSYSTEMRANK/RANKL/OPG 2 0
2 . 1 . 5 REMODELING 2 2
2 . 1 . 6 BIOMECHANIK DES HUEFTGELENKS 2 4
2.2 PARTIKELGENERATION 2 5
2.2.1 TRIBOLOGIE (REIBUNGSLEHRE) 2 5
2 . 2 . 2 BIOTRIBOLOGIE 2 6
2.2.2.1 IMPLANTATSYSTEMIMMANENTE URSACHEN DER PARTIKELPRODUKTION 28
2.2.2.2 PATIENTENABHAENGIGE PARAMETER 29
2.2.2.3 WERKSTOFFKUNDLICHES PROFIL DES TITANS, DER LEGIERUNG TI-6AI-4V
30 2.2.2.4 ZELLULAERE AUFNAHME VON SALZEN UND REIBKORROSIONSPRODUKTEN 32
2.3 KOMPLIKATIONEN 3 3
2.3.1 PATHOGENESE DER ASEPTISCHEN PROTHESENLOCKERUNG 33
2.3.2 PARTICLE DISEASE 3 4
2.3.2.1 PARTIKELGROESSE UND - MENGE 35
2.3.2.2 DISTRIBUTION DER PARTIKEL 36
2.3.2.3 ALLERGENE UND KANZEROGENE POTENZ 38
3 FRAGESTELLUNG 4 1
4 MATERIAL UND METHODEN 4 0
4.1 KNOCHENMARKPRAEPARATION 4 0
4.1.1 PATIENTENGUT 4 0
4 . 1 . 2 PROBENGEWINNUNG 4 0
4 . 1 . 3 PRAPARATIONSVORGANG 4 1
4 . 2 ZELLKULTUR 4 2
4.2.1 ZELLKULTUR VON H M S C 4 2
4 . 2 . 2 ZELLKULTUR VON H P O B 4 3
4 . 2 . 3 ZELLKULTUR DER FIBROBLASTEN 4 3
4 . 3 VERSUCH 4 4
4.3.1 IMMUNOPHAENOTYPISIERUNG DER H M S C 4 5
4 . 3 . 2 CHARAKTERISIERUNG DER ZELLPOPULATIONEN 4 6
4 . 3 . 3 ZELLAUSSAAT 4 6
4 . 3 . 4 CO-KULTURSYSTEM H M S C - BIOMATERIAL 4 6
I
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.4.1 LEGIERUNGSBESTANDTEILE 47
4.3.4.2 PARTIKELEXPOSITION 47
4.3.5 K I - 6 7 FLUORESZENZFAERBUNG 4 8
4 . 3 . 6 ZELLZAHLBESTIMMUNG ( C A S Y ) 4 9
4 . 3 . 7 APOPTOSE-ASSAY 5 0
4 . 3 . 8 DIFFERENZIERUNGSNACHWEISE 5 1
4.3.8.1 OSTEOGENE STIMULATION 51
4.3.8.2 FIXIERUNG DER ZELLEN 52
4.3.8.3 IMMUNZYTOCHEMISCHE FAERBUNGEN 52
4.3.9 OPG-BESTIMMUNG 5 2
4 . 4 WEITERE BILDGEBENDE VERFAHREN 5 3
4.4.1 FOTOGF(AFIE 5 3
4 . 4 . 2 RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE ( R E M ) 5 3
4.4.3 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE ( T E M ) 54
4.5 STATISTISCHE METHODE 5 5
4.6 VERBRAUCHSMATERIALIEN UND GERAETE 5 6
4.6.1 VERBRAUCHSMATERIALIEN/CHEMIKALIEN 5 6
4 . 6 . 2 C D - ANTIGENE DER F A C S - ANALYSE 5 7
4 . 6 . 3 REFERENZZELLLINIEN 5 8
4 . 6 . 4 PRIMAER- UND SEKUNDAERANTIKOERPER DER IMMUNFLUORESZENZ 5 8 4 . 6
. 5 GERAETE 5 8
5 ERGEBNISSE 6 0
5.1 CHARAKTERISIERUNG DER HMSC 6 0
5.2 GROESSENBESTIMMUNG DER TLVANIUMPARTIKEL 6 2
5.3 MORPHOLOGIE DER HMSC 6 3
5.3.1 MORPHOLOGIE DER UNSTIMULIERTEN H M S C 63
5.3.2 MORPHOLOGIE DER H M S C NACH INDUKTION DER OSTEOGENESE 6 4
5.4 LOKALISATION DER TLVANIUMPARTIKEL ANALYSE MITTELS BILDGEBENDER
VERFAHREN 6 5
5.4.1 FOTODOKUMENTATION DER LICHTMIKROSKOPIE 6 5
5 . 4 . 2 RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE ( S E M ) 6 6
5.4.2.1 BILDDOKUMENTATION DER RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE 66
5.4.2.2 DESKRIPTIVE ANALYSE DER ZELLMORPHOLOGIE UND PARTIKELLOKALISATION
MITTELS REM 69 5.4.3 BILDDOKUMENTATION DER
TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE ( T E M ) 7 0 5.4.3.1 HMSC IN
REINKULTUR (OHNE TIVANIUMPARTIKEL) NACH 14-TAEGIGER INKUBATION 70 5.4.3.2
HMSC IN COKULTUR MIT TIVANIUMPARTIKELN [10E5]
NACH 48-STUENDIGER INKUBATION 72
5.4.3.3 HMSC IN COKULTUR MIT TIVANIUMPARTIKELN [10E5] NACH 14-TAEGIGER
INKUBATION 74 5.5 ZELLZAHLBESTIMMUNG UND PROLIFERATIONSKONTROLLE 7 6
5.5.1 AUSWERTUNG UNDIFFERENZIERTER H M S C 7 6
5.5.1.1 ZELLZAHLBESTIMMUNG ZU EINEM FRUEHEN DETEKTIONSZEITPUNKT 76
5.5.1.2 ABSOLUTE ZELLZAHLBESTIMMUNG NACH 14 TAGEN 77
5.5.1.3 INSTRUMENTELLE ZELLZAHLBESTIMMUNG NACH 14 TAGEN 78
5.5.2 AUSWERTUNG DIFFERENZIERTER H M S C 7 9
5.5.2.1 DARSTELLUNG DER LICHTMIKROSKOPISCHEN ZELLKERNZAEHLUNG 79
5.5.2.2 PROLIFERATIONSKONTROLLE ERGEBNISSE DER KI-67
IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG 80 5.6 APOPTOSE-ASSAY 8 2
5.6.1 APOPTOSE-ASSAY NACH LAUFZEIT I ( 4 8 STUNDEN) 8 2
5 . 6 . 2 APOPTOSE-ASSAY NACH LAUFZEIT II ( 1 4 T A G E N ) 8 4
5.7 OSTEOPROTEGERIN ( O P G ) 8 5
5.8 DIFFERENZIERUNGSNACHWEISE IMMUNHISTOCHEMISCHE FAERBUNGEN (IHC) 8 5
II
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
5.8.1 ALKALISCHE PHOSPHATASE (ALK. P ) UND OSTEOPONTIN ( O P N ) 8 6
5.8.1.1 ALKALISCHE PHOSPHATASE (ALK. P) 86
5.8.1.2 OSTEOPONTIN (OPN) 87
5.8.2 KOLLAGEN I ( K O L L I ) UND OSTEOCALCIN ( O C N ) 89
5.8.2.1 KOLLAGEN I (KOLL I) 89
5.8.2.2 OSTEOCALCIN (OCN) 90
5.8.3 LOKALISATION DER PARTIKEL IN IMMUNHISTOCHEMISCHEN AUFNAHMEN 9 2
6 DISKUSSION 9 3
6.1 ZELLKULTUR 9 3
6.1.1 BASALE METHODEN DER ZELLKULTUR 9 3
6 . 1 . 2 BESCHAFFENHEIT DER EINGESETZTEN ZELLLINIEN 9 3
6 . 1 . 3 SPENDER UND ENTNAHMESTELLEN 9 4
6 . 2 VERSUCHSPHASE 9 5
6.2.1 CHARAKTERISIERUNG DER H M S C 9 5
6 . 2 . 2 COKULTUR VON C E M S C MIT BIOMATERIALIEN 9 7
6.2.2.1 GEOMETRIE UND MENGE DER PARTIKEL 98
6.2.2.2 ATTACHMENT UND INTERNALISIERUNG VON TIVANIUMPARTIKELN 98
6.2.2.3 ZELLMORPHOLOGIE UND PARTIKELENDOZYTOSE 100
6.2.2.4 APOPTOSE 101
6.2.2.4.1 APOPTOSEINDUKTION IN COKULTUREN HUMANER ZELLEN UND
BIOMATERIALIEN 102 6.2.2.5 PROLIFERATION 104
6.2.2.5.1 PROLIFERATIONSMARKER KI-67 107
6.2.2.6 OPG- RANK-RANKL-SYSTEM 109
6.2.2.6.1 UNTERSUCHUNGEN IM RAHMEN DER PATHOGENESE DER ENDOPROTHETIK 109
6.2.2.6.2 AUSWIRKUNGEN DES OPG AUF DAS IMMUNSYSTEM 111
6.2.2.7 OSTEOGENE DIFFERENZIERUNG IN VITRO 112
6.2.2.7.1 AUSWIRKUNG DER PARTIKELEXPOSITION AUF DIE OSTEOGENE
DIFFERENZIERUNG 114 6.2.2.7.2 ERGEBNIS UND DISKUSSION DER KOLLAGEN I
FAERBUNG 115
6.2.2.7.3 EXPRESSION DER ALKALISCHE PHOSPHATASE NACH PARTIKELPHAGOZYTOSE
115 6.2.2.7.4 OSTEOPONTINEXPRESSION NACH PARTIKELPHAGOZYTOSE 116
6.2.2.7.5 OSTEOCALCINWERTE UNTER DEM ASPEKT DER PARTIKELENDOZYTOSE 116
6.2.2.7.6 OSTEOGENE DIFFERENZIERUNG UND FUNKTION DER ZELLEN 117
6.3 FEHLERDISKUSSION UND KRITIK 1 1 8
7 ZUSAMMENFASSUNG 1 1 9
8 LITERATURVERZEICHNIS 1 2 2
9 PROTOKOLLTEIL 1 5 1
9.1 PASSAGIEREN VON ZELLEN 151
9.2 KRYOKONSERVIERUNG DER CEMSCS 151
9.3 AUFTAUENDERZELLEN 152
9 . 4 ZELLZAHLBESTIMMUNG 152
9.5 PROTOKOLL DER F A C S ZUR APOPTOSEBESTIMMUNG 152
9.6 PROTOKOLL DER F A C S ZUR IMMUNOTYPOPHAENISIERUNG 153
9.7 VORBEREITUNG DER GLASPLAETTCHEN 153
9.8 FIXIERUNGEN 153
9.9 BLOCKIERUNG UND IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG 1 5 4
9.10 RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE 155
9.11 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE (TEM) 156
III
IMAGE 4
1 0 VERZEICHNIS AKADEMISCHER LEHRER
11 DANKSAGUNG
INHALTSVERZEICHNIS
158
159
I V
|
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