Die Erkennung viraler Partikel durch Rezeptoren des angeborenen Immunsystems am Beispiel des HBV und AAV:
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Datensatz im Suchindex
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ZUSAMMENFASSUNG
1 EINLEITUNG
1.1 HEPATITIS B VIRUS (HBV) 1.1.1 EPIDEMIOLOGIE DES HUMANEN HBV
1.1.2 PARTIKELAUFBAU DES HBV
1.1.3 HUELLPROTEINE
1.1.4 GENOMORGANISATION
1.1.5 REPLIKATIONSZYKLUS
1.2 ADENO-ASSOZIIERTE VIREN (AAV)
1.2.1 PARTIKELAUFBAU UND REPLIKATIONSZYKLUS 1.2.2 GENTHERAPIE
1.3 DAS HUMANE IMMUNSYSTEM
1.3.1 DAS ANGEBORENE IMMUNSYSTEM
1.3.2 DAS ADAPTIVE IMMUNSYSTEM
1.4 REZEPTOREN DES ANGEBORENEN IMMUNSYSTEMS
1.4.1 TOLL-AEHNLICHE REZEPTOREN (TLR)
1.4.2 C-TYP LEKTIN REZEPTOREN (CLR)
1.4.3 RIG-I-AEHNLICHE HELIKASEN (RLR)
1.4.4 NOD-AEHNLICHE REZEPTOREN (NLR)
1.5 LEBERANATOMIE UND ZELLPOPULATIONEN
1.6 ZIELSETZUNG DER ARBEIT
2 MATERIAL & METHODEN
2.1 VERBRAUCHSMATERIALIEN UND CHEMIKALIEN 2.1.1 KITS
2.1.2 CHEMIKALIEN & REAGENZIEN
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.1.3 MEDIEN UND MEDIENZUSAETZE 38
2.1.4 EUKARYOTISCHE ZELLLINIEN 3 8
2.1.5 ENZYME 39
2.1.6 GEWICHTS- UND LAENGENSTANDARDS 39
2.1.7 OLIGONUKLEOTIDE 39
2.1.8 RADIOISOTOPE 41
2.1.9 ANTIKOERPER 41
2.1.10 VERBRAUCHSMATERIAL 41
2.1.11 GERAETE 42
2.1.12 SOFTWARE 43
2.1.13 STATISTIK 43
2.2 VERWENDETE LOESUNGEN UND PUFFER 43
2.3 ZELLKULTURMEDIEN 44
2.4 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 46
2.4.1 ETABLIERUNG VON INFEKTIOESEN HBV STOCKS
UND NEGATIV-KONTROLLEN 46
2.4.1.1 AUSSAEEN UND KULTIVIEREN VON HEPG2.215 UND HEPG2 ZELLEN 46
2.4.1.2 KONZENTRATION VON HBV AUS DEM ZELLKULTURMEDIUM 46
2.4.2 ETABLIERUNG VON RAAV STOCKS, LEEREN AAV KAPSIDEN UND
NEGATIV-KONTROLLE 47
2.4.3 ISOLATION UND KULTIVIERUNG PRIMAERER HUMANER ZELLEN 47
2.4.3.1 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL UND VITALITAET 47
2.4.3.2 LEBERZELL-MISCHKULTUREN 48
2.4.3.3 HOCHREINE HUMANE LEBERZELLKULTUREN 49
2.4.3.4 PRIMAERE HUMANE LEUKOZYTEN AUS BLUT 50
2.4.3.5 DIFFERENZIERUNG VON PRO-INFLAMMATORISCHEN MO AUS MONOZYTEN 51
2.4.3.6 THP-1 ZELLEN 51
2.4.3.7 KULTIVIERUNG VON HEK-293 UND HEK-293/TLR2 ZELLEN 51
2.4.3.8 ISOLATION MURINER MO 52
2.4.4 INFEKTIONSVERSUCHE UND AKTIVITAETSTESTS 52
2.4.4.1 HBV-INFEKTION VON PHH UND NPC 52
II
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
2.4.4.2 INKUBATION VON ZELLEN MIT HBV 52
2.4.4.3 INFEKTION MIT AAV PARTIKELN 53
2.4.4.4 INKUBATION VON ZELLEN MIT LIGANDEN FUER
MUSTERERKENNUNGSREZEPTOREN 53
2.4.4.5 LAGERUNG DER ABGENOMMENEN ZELLKULTURMEDIEN 54
2.4.5 IMMUNFARBUNG 54
2.4.6 AUFNAHME VON ACETYLIERTEM LOW-DENSITY-LIPOPROTEIN 55
2.5 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 55
2.5.1 RNA-ISOLATION AUS ZELLEN 55
2.5.1.1 RNA-ISOLATION MITTELS TRIZOL REAGENZ 55
2.5.1.2 RNA-ISOLATION MITTELS PEQLAB REAGENZ 55
2.5.1.3 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA UND RNA 56
2.5.1.4 DNA VERDAU IN RNA PROBEN 57
2.5.2 CDNA SYNTHESE 57
2.5.3 QUANTITATIVE LIGHT CYCLER ECHTZEIT-PCR (QPCR) 57
2.5.4 DNA-ISOLATION AUS HBV PARTIKELN 60
2.5.5 AGAROSEGELELEKTROPHORESE DNA 61
2.5.6 DOT-BLOT ANALYSE (HBV DNA) 61
2.5.7 UEBERPRUEFUNG DER ZELLKULTUREN AUF MYKOPLASMEN MITTELS PCR 62
2.6 BIOCHEMISCHE METHODEN 64
2.6.1 ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY 64
2.6.2 MESSUNG DER HBV-ANTIGENSEKRETION 64
2.6.3 AUFREINIGUNG VON HBV PARTIKELN 64
2.6.3.1 ANREICHERUNG VIRALER PARTIKEL DURCH
HEPARIN-AFFINITAETS-CHROMATOGRAPHIE 64 2.6.3.2 AUFREINIGUNG VON HBV
PARTIKELN MITTELS SACCHAROSE DICHTEGRADIENTEN 65
2.6.4 TITERBESTIMMUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER HBV-STOCKS 66
3 ERGEBNISSE 67
3.1 ISOLATION PRIMAERER HUMANER LEBERZELLEN 67
3.1.1 ISOLATION UND IDENTIFIZIERUNG 67
3.1.2 CHARAKTERISIERUNG DER TLR IN DEN ZELLPOPULATIONEN 69
III
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
3.2 ERKENNUNG VON VIREN IN LEBERZELLEN 71
3.2.1 ERKENNUNG VON HBV 71
3.2.2 ERKENNUNG VON AAV 75
3.3 BETEILIGUNG VON TLR UND CLR AN DER ERKENNUNG
VIRALER PARTIKEL 76
3.3.1 HBV VIRIONEN UND KAPSIDE WERDEN VON HUMANEN MO ERKANNT 79 3.3.2
ERKENNUNG VIRALER PARTIKEL DURCH TLR 80
3.3.2.1 DIE ERKENNUNG VON HBV BEANSPRUCHT DIE TLR SIGNALKASKADE 80
3.3.2.2 HBV INDUZIERT TLR 2 EXPRESSION 83
3.3.2.3 HBV-SPEZIFISCHE IL-8 INDUKTION IN HEK293-TLR2 83
3.3.2.4 DIE ERKENNUNG VON HBV DURCH KC, LSEC UND MO IST TLR 2-ABHAENGIG
84
3.3.2.5 DIE ERKENNUNG VON AAV IST TLR 2-ABHAENGIG 87
3.3.2.6 TLR 9 IST NICHT AN DER ERKENNUNG VON HBV BETEILIGT 88
3.3.3 ERKENNUNG VON HBV DURCH CLR 90
3.3.3.1 DIE ERKENNUNG VON HBV ERFORDERT EINE CLATHRIN-ABHAENGIGE
PHAGOZYTOSE 91 3.3.3.2 DIE HBV-ERKENNUNG IST CALCIUM-ABHAENGIG 92
3.3.3.3 UNTERSUCHUNG DER ITAM-MOTIV-REZEPTOR SIGNALKASKADE 93
3.3.3.4 HBV ERKENNUNG ERFORDERT ENDOSOMALE REIFUNG 95
3.3.3.5 DER MANNOSE REZEPTOR UND DIE ERKENNUNG VON HBV 96
4 DISKUSSION 99
4.1 ISOLATION PRIMAERER HUMANER LEBERZELLEN 99
4.2 ERKENNUNG VIRALER PARTIKEL DURCH TLR 103
4.2.1 ERKENNUNG VON HBV PARTIKELN 103
4.2.2 ERKENNUNG VON AAV KAPSIDEN 109
4.3 ERKENNUNG VIRALER PARTIKEL DURCH CLR 110
4.4 ZUSAMMENFASSUNG 113
5 ABKUERZUNGEN UND ABBILDUNGEN 115
5.1 ABKUERZUNGEN 115
IV
IMAGE 5
5.2 ABBILDLINGSVERZEICHNIS
5.3 TABELLENVERZEICHNIS
6 LITERATURVERZEICHNIS
DANKSAGUNG
INHALTSVERZEICHNIS
119
120
121
149
V
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