Die Bedeutung von Annexin-Kollagen-X-Interaktionen für die enchondrale Ossifikation und Hämatopoese:
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| adam_text | Titel: Die Bedeutung von Annexin-Kollagen-X-Interaktionen für die enchondrale Ossifikation und Hämatopoes
Autor: Grskovic, Ivan
Jahr: 2012
Inhaltsverzeichnis
Kurzzusammenfassung........................................................................................................4
Abstract.................................................................................................................................6
Abkürzungsverzeichnis........................................................................................................7
1. Einleitung..........................................................................................................................9
1.1 Die Entwicklung des Skelettsystems.............................................................................9
1.2 Aufbau von Röhrenknochen und Struktur der Wachstumsfuge....................................11
1.3 Matrixvesikel und ihr Einfluss auf die Kalzifizierung des Knorpels............................12
1.4 Die Extrazelluläre Matrix des Knorpels.......................................................................13
1.4.1 Struktur und Funktionen der Kollagene II und X..................................................15
1.4.2 Kollagen X assoziierte humane Chondrodysplasie und die Auswirkung
von Mutationen und der Geninaktivierung von Kollagen X im Mausmodell.........16
1.5 Die Proteinfamilie der Annexine.................................................................................17
1.5.1 Proteinstruktur der Annexine................................................................................18
1.5.2 Annexine als Vermittler der Knorpelmineralisierung............................................19
1.6 Annexin-Kollagen Interaktionen initiieren die Vesikel-vermittelte
Knorpelkalzifizierung in vitro.....................................................................................20
1.7 Zielsetzung.................................................................................................................23
2. Material und Methoden..................................................................................................24
2.1 Materialien..................................................................................................................24
2.1.1 Chemikalien.........................................................................................................24
2.1.2 Lösungen und Puffer............................................................................................24
2.1.3 Enzyme................................................................................................................24
2.1.4 Analysesätze........................................................................................................25
2.1.5 Oligonukleotide....................................................................................................25
2.1.6 Antikörper............................................................................................................26
2.1.7 Bakterien und Nährmedien...................................................................................27
2.2 Methoden....................................................................................................................28
2.2.1 Molekularbiologische Methoden..........................................................................28
2.2.1.1 Polymerasekettenreaktion (PCR)...................................................................28
2.2.1.2 Agarose-Gelelektrophorese...........................................................................29
2.2.1.3 Restriktionsendonukleasen DNA-Verdau......................................................29
2.2.1.4 Dephosphorylierung und Ligation von DNA-Fragmenten..............................29
2.2.1.5 Transformation von Bakterien.......................................................................30
2.2.1.6 Isolierung bakterieller Plasmide.....................................................................30
2.2.1.7 DNA- Konzentrationsbestimmung.................................................................30
2.2.1.8 Sequenzierung...............................................................................................30
2.2.1.9 RNA Isolierung aus Gefrierschnitten von Wachstumsfugen...........................31
2.2.1.10 Microarray-Analyse.....................................................................................31
2.2.1.11 Quantitative PCR (qPCR)............................................................................32
2.2.2 Versuchstierarbeiten.............................................................................................32
2.2.2.1 Tierhaltung....................................................................................................32
2.2.2.2 Mausmodelle.................................................................................................32
2.2.2.3 Isolierung genomischer DNA aus Schwanzbiopsien
mittels Isopropanol- und Ethanolfällung........................................................33
2.2.2.4 Isolierung hochreiner DNA aus Schwanzbiopsien
über Phenol/Chloroform Extraktion...............................................................33
2.2.2.5 Genotypisierung von Mäusen........................................................................33
2.2.3 Histologie............................................................................................................34
2.2.3.1 Gewebefixierung...........................................................................................34
2.2.3.2 Demineralisierung.........................................................................................35
2.2.3.3 Paraffineinbettung der fixierten demineralisierten Knochen...........................35
2.2.3.4 Herstellung von Paraffinschnitten..................................................................36
2.2.3.5 Entparaffinierung von Gewebepräparaten......................................................36
2.2.3.6 Gewebeffirbungen..........................................................................................36
2.2.3.6.1 Hämatoxylin Eosin/Alcian Blau (H E/Alcian Blau) Färbung.............36
2.2.3.6.2 Von Kossa/Fast Green/Safranin O Färbung
zur Darstellung von Minaralablagerungen im Knochengewebe...............37
2.2.3.6.3 Kollagennachweis über Picrosirius Rot Färbung.....................................38
2.2.3.6.4 Veranschaulichung mineralisierter und knorpeliger
Skelettelemente durch Alizarin Rot/Alcian Blau Färbung.......................38
2.2.3.6.5 Osteoklastennachweis mittels TRAP Färbung.........................................39
2.2.3.6.6 Immunofluoreszenzfärbungen zum Nachweis von Knorpelproteinen......40
2.2.3.7 Mikroskopie..................................................................................................41
2.2.4 Morphometrische und ultrastrukturelle Analysen.................................................42
2.2.4.1 Längen-, Breiten- und Flächenvermessung skeletaler Elemente.....................42
2.2.4.2 Bestimmung des Knochenmineralgehaltes von Mäusen
durch Periphere Quantitative Computertomographie (PQCT)........................42
2.2.4.3 Elektronenmikroskopie..................................................................................43
2.2.4.4 Datenauswertung...........................................................................................44
2.2.5 Proteinbiochemische Untersuchungen..................................................................44
2.2.5.1 Herstellung von Wachstumsfugenlysaten.......................................................44
2.2.5.2 Proteinkonzentrationsbestimmung.................................................................45
2.2.5.3 SDS-Polyacrylamidgelektrophorese(SDS-PAGE).........................................45
2.2.5.4 Western Blot.................................................................................................46
2.2.5.5 Immunologischer Nachweis von Proteinen....................................................46
2.2.5.6 Chemolumineszenz-Reaktion........................................................................47
2.2.6 Durchflusszytometrie...........................................................................................47
2.2.6.1 Isolierung von Immunzellen lymphatischer Organe für FACS-Messungen ....47
2.2.6.2 Markierung der Zellen durch Antikörper.......................................................48
3. Ergebnisse.......................................................................................................................49
3.1 Analyse der Skelettentwicklung in Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-) gendefizienten Mäusen............49
3.1.1 Genotypisierung der Anxa5(-/- /Anxa6(-/-) Mäuse
und Bestimmung der Mendelschen Verteilung.....................................................49
3.1.2 Nachweis des Proteinverlustes
in der Wachstumsfuge Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-) Mäuse.................................................50
3.1.3 Das Skelettsystem neugeborener Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-) Mäuse
ähnelt dem Skelett der Wildtyp-Tiere...................................................................51
3.1.4 Die Wachstumsfugen juveniler Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-) Mäuse weisen
keine Veränderungen in der Morphologie oder der Verteilung
extrazellulärer Matrixproteine auf........................................................................53
3.1.5 Die Produktion und Verteilung von Matrixvesikeln in der Wachstumsfuge
Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-) Mäuse ähnelt der Verteilung in Wildtyp-Tieren......................56
3.1.6 Die Organisation der Wachstumsfuge aduker Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-) Mäuse
ist nicht beeinträchtigt..........................................................................................58
3.1.7 Die Röhrenknochen adulter Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-) Tiere
weisen einen ähnlichen Mineralgehalt wie Wildtyp-Mäuse auf.............................59
3.2 Analyse der in der Wachstumsfuge von Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-) Mäusen
exprimierten Annexine................................................................................................60
3.2.1 Isolierung der RNA aus der Wachstumsfuge
von Wildtyp- und Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-)Tieren........................................................61
3.2.2 Die verbleibenden Annexine sind
in der Wachstumsfuge der Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-) Mäuse nicht reguliert....................62
3.2.3 Gene des Zellwachstums und Zellstoffwechsels sind
in Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-) Tieren unterschiedlich reguliert..........................................63
3.3 Analyse der Skelettentwicklung von Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-)/CollO(-/-)
dreifach-gendefizienten Mäusen..................................................................................65
3.3.1 Generierung von Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-)/Coll0(-/-) gendefizienten Mäusen
und Bestimmung der Mendelschen Verteilung des CollO Allels...........................66
3.3.2 Der Verlust der Proteine AnxA5, AnxA6 und CollO
wurde in Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-)/CollO(-/-) Tieren bestätigt.........................................66
3.3.3 Der Skelettaufbau neugeborener Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-)/CollO(-/-) Tiere
ähnelt dem Aufbau der Wildtyp-Tiere..................................................................67
3.3.4 Veränderungen in der Wachstumsfuge von CollO(-/-)*und
Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-)/Col10(-/-) neugeborenen Tieren................................................71
3.3.5 Die Wachstumsfugenstruktur 13 Tage alter Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-)/Coll0(-/-) Tiere
ähnelt dem Aufbau in Wildtyp-Tieren..................................................................74
3.3.6 Die Organisation der Wachstumsfuge und die Morphologie
des Trabekelknochens ein Monat alter mutanter Tiere ist nicht gestört.................75
3.3.7 Die Struktur des Trabekelknochens in den Femora
mutanter Mäuse ähnelt dem Aufbau in Wildtyp-Tieren........................................77
3.3.8 Die Verteilung extrazellulärer Matrixproteine innerhalb
der Wachstumsfuge und des Trabekelknochens ein Monat alter
mutanter Tiere ist nicht verändert.........................................................................78
3.3.9 Der Umfang des Kortikalknochens ist in den Femora
der CollO(-/-) und Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-)/CollO(-/-) Tiere verringert.............................80
3.3.10 Die veränderte Knochenstruktur CollO(-/-) und
Anxa5(-/-)/Anxa6(-/-)/CollO(-/-) Tiere beeinflusst die Reifung von Immunzellen.....82
4. Diskussion.......................................................................................................................89
4.1 Die Annexine AnxA5 und AnxA6 besitzen keinen
wesentlichen Einfluss auf die Skelettentwicklung.......................................................89
4.2 Annexin-Kollagen Interaktionen sind für die Einleitung der
Matrixvesikel-vermittelten Knorpelkalzifizierung in vivo nicht relevant......................92
4.3 Der Einfluss von Kollagen X auf die Skelettentwicklung und Hämatopoese................96
4.4 Ausblick...................................................................................................................100
Literaturverzeichnis.........................................................................................................102
Danksagung......................................................................................................................112
Publikationen....................................................................................................................113
Erklärung..........................................................................................................................114
Lebenslauf.........................................................................................................................115
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