Generierung neuer HIV-1 Impfstoffkandidaten zur Induktion breit neutralisierender Antikörper mit Cholera Toxin B als Trägerprotein:
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2011
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INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG 1
A EINLEITUNG 2
A.1 PROBLEMATIK UND STAND DER HIV IMPFSTOFFENTWICKLUNG 2
A.1.1 HIV WEIST EIN HOHE DIVERSITAET UND VARIABILITAET AUF 2
A.1.2 DAS HIV-1 HUELLPROTEIN ENV IST FUER DEN ERSTEN SCHRITT DER INFEKTION
VERANTWORTLICH 3
A.1.3 FUER EINE STERILE IMMUNITAET GEGEN HIV IST DIE INDUKTION BREIT
NEUTRALISIERENDER ANTIKOERPER
ERFORDERLICH 4
A.1.3.1 ALLE BISHER IDENTIFIZIERTEN BREIT NEUTRALISIERENDEN ANTIKOERPER
SIND GEGEN VIER
BEREICHE VON ENV GERICHTET 5
A.1.3.2 PASSIVE IMMUNISIERUNGSSTUDIEN BEWIESEN DIE WIRKSAMKEIT BREIT
NEUTRALISIERENDER
ANTIKOERPER 6
A.1.3.3 RATIONALES ANTIGENDESIGN KOENNTE DIE INDUKTION BREIT
NEUTRALISIERENDER ANTIKOERPER
VERMITTELN 7
A.1.4 HUMORALE UND ZELLULAERERE IMMUNANTWORTEN ERGAENZEN SICH BEI DER
VIRUSBEKAEMPFUNG 8
A.1.5 VIRUSAEHNLICHE PARTIKEL SIND EINE VIELVERSPRECHENDE KOMPONENTE DER
MODERNEN
VAKZINEENTWICKLUNG 9
A.1.6 HETEROLOGE PRIME-BOOST STRATEGIEN ERHOEHEN DAS POTENTIAL VON
VAKZINEKANDIDATEN 10
A.1.7 DER MUKOSALEN IMMUNANTWORT WIRD EINE SCHLUESSELROLLE BEI DER
KONTROLLE UEBER HIV- INFEKTIONEN ZUGESPROCHEN 11
A.2 DAS MOLEKULARE ADJUVANS CHOLERA TOXIN B (CTB) 11
A.2.1 ADJUVANTIEN VERSTAERKEN DIE DURCH EIN SPEZIFISCHES ANTIGEN
INDUZIERTE IMMUNANTWORT.... 11
A.2.2 CTB IST DIE NICHT TOXISCHE UNTEREINHEIT DES ENTEROTOXINS VON
VIBRIO CHOLERAE 12
A.2.3 CTB IST EIN POTENTER STIMULATOR DER MUKOSALEN IMMUNANTWORT UND
BIRGT DIE MOEGLICHKEIT
GLEICHZEITIG ALS ANTIGEN-TRAEGER EINGESETZT ZU WERDEN 12
A.3 ZIELSETZUNG 13
B MATERIAL UND METHODEN 14
B.1 MOLEKULARBIOLOGIE 14
B.2 ZELLBIOLOGIE 15
B.2.1 ZELLLINIEN UND KULTIVIERUNG 15
B.2.2 TRANSIENTE TRANSFEKTION EUKARYONTISCHER ZELLEN 16
B.2.3 ERNTE VON HEK293T ZELLEN UND UEBERSTAENDEN FUER ANALYTISCHE ZWECKE 17
B.2.4 FACS-ANALYSE 17
B.2.5 PRODUKTION VIRUSAEHNLICHER PARTIKEL (VLP) IN HUMANEN ZELLEN 18
B.2.6 PRODUKTION VON VLPS MIT REKOMBINANTEM BAKULOVIRUS 18
B.2.6.1 VERMEHRUNG VON BAKULOVIRUSSTOCKS 18
B.2.6.2 INFEKTION VON HIGH FIVE ZELLEN ZUR PRODUKTION VON VLPS 18
B.2.7. ANREICHERUNG VON VLPS UEBER ULTRAZENTRIFUGATION 18
B.3 PROTEINBIOCHEMIE 19
B.3.1 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 19
B.3.2 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 19
B.3.3 WESTERN-BLOT ANALYSE 19
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
B.3.4 NACHWEIS VON PROEOE 639 MITTELS ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY
(ELISA) 20
B.3.5 QUANTIFIZIERUNG VON PROTEINEN UEBER SDS-PAGE 21
B.3.6 AUFBEREITUNG VON VLPS UEBERZONALZENTRIFUGATION IM
SACCHAROSEGRADIENT 21
B.3.7 FAELLUNG VON PROTEINEN MIT TRICHLORESSIGSAEURE 21
B.3.8 QUANTIFIZIERUNG DER BELADUNG VON VLPS MIT CHIMAEREM CTB 21
B.3.9 IMMUNOGOLDMARKIERUNG UND ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE AUFNAHME VON
VLPS 22
B.3.10 CHEMISCHE QUERVERNETZUNG CHIMAERERER CTB PROTEINE AUF DER
VLP-OBERFLAECHE 23
B.3.11 PROTEINEXPRESSION IN E. COLI 23
B.3.12 GM1 ELISA 24
B.3.13 CTB ELISA 25
B.3.14 CHEMISCHE KOPPLUNG VON LOESLICHEM CTB AN VLPS 26
B.3.14.1 KOPPLUNG MITTELS BIOTINYLIERUNG UND STREPTAVIDIN 26
B.3.14.2 KOPPLUNG MITTELS SULFO-NHS 26
B.3.15 TEST IN VIVO EINGESETZTER PROBEN AUF ENDOTOXIN 26
B.4 IMMUNOLOGIE 26
B.4.1 HALTUNG UND IMMUNISIERUNG VON VERSUCHSTIEREN 26
B.4.2 AUSLESEN HUMORALER IMMUNANTWORTEN 27
B.4.2.1 GEWINNUNG VON SEREN 27
B.4.2.2 GESAMTIMMUNGLOBULIN ELISA 27
B.4.2.3 AUSLESEN NEUTRALISIERENDER AKTIVITAET 28
B.4.3 AUSLESEN MUKOSALER IMMUNANTWORTEN 28
B.4.3.1 BRONCHOALVEOLARE LAVAGE (BAL) 28
B.4.3.2 IGA ANTIKOERPER ELISA 28
B.4.4 AUSLESEN ZELLULAERER IMMUNANTWORTEN 29
B.4.4.1 GENERIERUNG PRIMAERER MAUSSPLENOZYTEN 29
B.4.4.2 INTRAZELLULAERE IFNY FAERBUNG MIT FACS ANALYSE 29
C ERGEBNISSE 31
C.1 KONZEPTION UND BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG CHIMAERER CTB-VARIANTEN
31
C.1.1 PRAESENTATION VON CHIMAEREM CTB AUF DER OBERFLAECHE VIRUSAEHNLICHER
PARTIKEL MITTELS
TRANSMEMBRANDOMAENE 31
C.1.1.1 ENTWICKLUNG CHIMAERER CTB-VARIANTEN MIT TRANSMEMBRANDOMAENE 31
C.1.1.2 DIE KONSTRUIERTEN CTB-VARIANTEN WERDEN EXPRIMIERT UND AUF DER
ZELLOBERFLAECHE
PRAESENTIERT 33
C.1.1.3 DAS MIMOTOP DER CTB-VARIANTEN IST FREI ZUGAENGLICH UND WIRD DURCH
BREIT
NEUTRALISIERENDE ANTIKOERPER GEBUNDEN 34
C.1.1.4 CTB-VARIANTEN MIT CD34-TRANSMEMBRANDOMAENE WERDEN EFFIZIENT IN
VLPS
EINGEBAUT 36
C.1.1.5 AUF VLPS BEFINDLICHES CTB OLIGOMERISIERT ZU PENTAMEREN 39
C.1.1.6 LAENGE UND SEQUENZ INTEGRIERTER MIMOTOPE BEEINFLUSSEN DIE
KONFORMATION VON
CTB UND DIE ZUGAENGLICHKEIT DES MIMOTOPS 41
C.1.2 CHIMAERES CTB IN LOESLICHER FORM 44
II
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
C.1.2.1 ENTWICKLUNG CHIMAERER CTB-VARIANTEN IN LOESLICHER FORM 44
C.1.2.2 PRODUKTION DER LOESLICHEN CTB-VARIANTEN 45
C.1.2.3 LOESLICHES CHIMAERES CTB BINDET AN GM1 UND EXPONIERT SEIN MIMOTOP
FREI
ZUGAENGLICH FUER BREIT NEUTRALISIERENDE ANTIKOERPER 46
C.1.2.4 PRODUKTION DER CHIMAEREN CTB-VARIANTEN IN GROESSEREM MASSSTAB FUER
IMMUNISIERUNGSEXPERIMEMTE 47
C.1.3 PRAESENTATION VON CHIMAEREM CTB AUF DER OBERFLAECHE VIRUSAEHNLICHER
PARTIKEL DURCH
CHEMISCHE KOPPLUNG 48
C.1.4 RELATIVE QUANTIFIZIERUNG DER BELADUNG VON VLPS MIT CTB 49
C.2 IMMUNOGENITAET CHIMAERER CTB-VARIANTEN 50
C.2.1 ADJUVANS-EFFEKT VON CTB 50
C.2.1.1 IM HUMANEN SYSTEM PRODUZIERTE VLPS INDUZIEREN OHNE ADJUVANS
KEINE GAG
SPEZIFISCHE MUKOSALE IMMUNANTWORT 51
C.2.1.2 DIE PRAESENTATION VON CTB AUF VLPS MITTELS TRANSMEMBRANDOMAENE
SOWIE DAS
BEIMISCHEN VON CTB INDUZIEREN EINE GAG-SPEZIFISCHE MUKOSALE IMMUNANTWORT
53
C.2.1.3 IM BAKULOVIRALEN SYSTEM PRODUZIERTE VLPS SIND AUFGRUND IHRER
VERUNREINIGUNG MIT
BAKULOVIREN HOCH IMMUNOGEN UND EIGNEN SICH DAHER NICHT ALS MESSGROESSE FUER
EINEN CTB- SPEZIFISCHEN ADJUVANS-EFFEKT 54
C.2.1.4 DER ADJUVANS-EFFEKT VON LOESLICH BEIGEMISCHTEM CTB AUF
GAG-SPEZIFISCHE
IMMUNANTWORTEN BLEIBT BEI PRAESENTATION EINES MIMOTOPS ERHALTEN 56
C.2.1.5 CTB IST IM STANDE, HUMORALE UND MUKOSALE IMMUNANTWORTEN GEGEN
EIN
FUSIONIERTES PEPTID ZU INDUZIEREN 58
C.2.1.6 MITTELS TRANSMEMBRANDOMAENE AUF VLPS VERANKERTES CTB INDUZIERT
AUCH BEI PRAESENTATION
EINES MIMOTOPS GAG-SPEZIFISCHE HUMORALE IMMUNANTWORTEN 60
C.2.2 FOKUSSIERUNG DER HUMORALEN IMMUNANTWORT AUF EIN ENV EPITOP 61
C.2.2.1 EINE HETEROLOGE PR/ME-SSOOSF-LMMUNISIERUNG MIT GP41 KODIERENDER
DNA UND
MNCTBGST FUEHRT ZUR INDUKTION MIMOTOP-SPEZIFISCHER HIV-1 ENV ANTIKOERPER
MIT
MODERATER CLADE UEBERGREIFENDER NEUTRALISATIONSAKTIVITAET 62
C.2.2.2 AUCH DIE VERABREICHUNG VON VLP/MNCTB-CD34TM INDUZIERT NACH EINER
GP41
PLUS GAG DNA GRUNDIMMUNISIERUNG MIMOTOP-SPEZIFISCHE HIV-1 ENV ANTIKOERPER
64
C.2.2.3 DIE IMMUNISIERUNG VON KANINCHEN BESTAETIGT DEN VORTEIL EINER
HETEROLOGEN GP41
DNA PRIME UND VLP/MNCTB-CD34TM BOOST KOMBINATION 67
D DISKUSSION 68
D.1 KONZEPTION UND BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG CHIMAERER CTB-VARIANTEN
68
D.1.1 DAS PRAESENTIERTE MIMOTOP ENTHAELT DIE HOCH KONSERVIERTEN, LINEAREN
EPITOPE VON ZWEI
BEKANNTEN BREIT NEUTRALISIERENDEN ANTIKOERPERN 68
D.1.2 DAS MUKOSALE ADJUVANS CTB IST EIN IDEALES TRAEGERPROTEIN ZUR
PRAESENTATION EINES
MIMOTOPS 68
D.1.3 DURCH DAS DISPLAY VON CHIMAEREM CTB AUF VIRUSAEHNLICHEN PARTIKELN
WIRD DIE NATIVE
VIRUSSITUATION NACHGEAHMT UND DAS ZELLULAERE IMMUNSYSTEM ANGESPROCHEN 69
III
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
D.1.4 ALLE KONSTRUIERTEN CHIMAEREN CTB-VARIANTEN WERDEN EXPRIMIERT UND
KOENNEN DURCH EINE
TRANSMEMBRANDOMAENE EFFIZIENT AUF DER ZELLOBERFLAECHE PRAESENTIERT WERDEN
71
D.1.5 DIE PRAESENTATION EINES MIMOTOPS MITTELS CTB ERZIELT EINE
VERBESSERTE ZUGAENGLICHKEIT
DER EPITOPE VON 2F5 UND 4E10 72
D.1.6 CHIMAERE CTB-VARIANTEN MIT CD34 TRANSMEMBRANDOMAENE WERDEN EFFIZIENT
IN VLPS
EINGEBAUT UND IN FORM VON PENTAMEREN AUF DEREN OBERFLAECHE PRAESENTIERT 72
D.1.7 IN LOESLICHER FORM PRODUZIERTE CHIMAERE CTB-VARIANTEN WEISEN EINE
SPEZIFISCHE BINDUNG
AN GM1 AUF 73
D.1.8 CHEMISCHE KOPPLUNG ERMOEGLICHT DIE PRAESENTATION VON LOESLICHEN
CTB-VARIANTEN AUF IN
VERSCHIEDENEN SYSTEMEN PRODUZIERTEN VLPS 74
D.2 IMMUNOGENITAET CHIMAERER CTB-VARIANTEN 75
D.2.1 ADJUVANS-EFFEKT VON CTB 76
D.2.1.1 DURCH CHEMISCHE KOPPLUNG AUF VLPS PRAESENTIERTES CTB ERZIELT
NICHT DENSELBEN
ADJUVANS-EFFEKT WIE MITTELS TRANSMEMBRANDOMAENE AUF VLPS PRAESENTIERTES
CTB 76
D.2.1.2 IM BAKULOVIRALEN SYSTEM PRODUZIERTE VLPS EIGNEN SICH NICHT WIE
IN HUMANEN
ZELLEN PRODUZIERTE VLPS ZUR MESSUNG DES ADJUVANS-EFFEKTS VON CHIMAEREM
CTB 77
D.2.1.3 DER ANHAND GAG-SPEZIFISCHER IMMUNANTWORTEN GEZEIGTE
ADJUVANS-EFFEKT VON
MITTELS TRANSMEMBRANDOMAENE AUF VLPS VERANKERTEM SOWIE LOESLICH
BEIGEMISCHTEM
CTB BLEIBT BEI PRAESENTATION EINES MIMOTOPS ERHALTEN 77
D.2.2 FOKUSSIERUNG DER HUMORALEN IMMUNANTWORT AUF EIN ENV EPITOP 79
D.2.2.1 EINE HETEROLOGE PRIME-BOOST- IMMUNISIERUNG MIT GP41 D N A UND
MNCTBQST FUEHRT
ZUR INDUKTION MIMOTOP-SPEZIFISCHER HIV-1 ENV ANTIKOERPER MIT MODERATER
CLADE
UEBERGREIFENDER NEUTRALISATIONSAKTIVITAET 79
D.2.2.2 SELBST EINE HETEROLOGE PRIME-SSOOSF-LMMUNISIERUNG MIT GAG D N A
KANN DURCH
BOOST MIT EINER KOMBINATION AUS VLPS UND MNCTBGST ZUR INDUKTION MIMOTOP-
SPEZIFISCHER HIV-1 ENV ANTIKOERPER FUEHREN 80
D.2.2.3 DIE VERABREICHUNG VON VLP/MNCTB-CD34TM INDUZIERT NACH EINER DNA
GRUNDIMMUNISIERUNG MIMOTOP-SPEZIFISCHE HIV-1 ENV ANTIKOERPER BEI MAEUSEN
UND
KANINCHEN 81
D.3 AUSBLICK 82
E ANHANG 83
E.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 83
E.2 DNA-KONSTRUKTE 84
E.2.1 VEKTOREN 84
E.2.2 CHIMAERE CTB-VARIANTEN MIT TRANSMEMBRANDOMAENE 84
E.2.3 CHIMAERE CTB-VARIANTEN ZUR PRODUKTION IN LOESLICHER FORM 85
E.2.4 WEITERE VERWENDETE KONSTRUKTE 86
E.3 PEPTIDE 89
E.4 ERGAENZENDE ABBILDUNGEN 90
E.5 LITERATURVERZEICHNIS 91
DANKSAGUNG 103
IV
|
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| author | Kapzan, Ruth |
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