Der Einfluss posttranslationaler Modifikationen auf die Funktion des Tight Junction-Proteins Occludin:
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2010
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INHALTSVERZEICHNIS
1 . EINLEITUNG 1
1.1 TIGHT JUNCTIONS (TJ) 4
1.1.1. JUNCTIONAL ADHESION MOLECULE (JAM) 5
1.1.2. DIE CLAUDIN-PROTEINFAMILIE 6
1.1.3. DIE ZONULA OCCLUDENS PROTEINE (ZO-PROTEINE) 6
1.1.4. TRICELLULIN 7
1.2 OCCLUDIN 7
1.2.1. DIE FUNKTION VON OCCLUDIN 8
1.2.2. PHOSPHORYLIERUNG VON OCCLUDIN 9
1.2.3. PHOSPHORYLIERUNG VON OCCLUDIN DURCH CKI UND CKII 11
1.3 ZIELSETZUNG 12
2 . M A T E R I A L I E N 1 4
2.1 CHEMIKALIEN 14
2.2 V E R B R A U C H S M A T E R I A L I E N 15
2.3 M O L E K U L A R B I O L O G I S C H E M A T E R I A L I E N 16
2.3.1. CDNAS 16
2.3.2. EXPRESSIONSVEKTOREN 16
2.3.3. OLIGONUKLEOTIDE UND PRIMER 17
2.3.4. BAKTERIENSTAEMME 19
2.4 P R O T E I N B I O C H E M I S C H E M A T E R I A L I E N 19
2.4.1. MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS 19
2.4.2. ANTIKOERPER 19
2.4.3. ENZYME 21
2.5 ZELLKULTUR 21
2.5.1. MEDIEN UND LOESUNGEN 21
2.5.2. EUKARYONTISCHE ZELLLINIEN 21
2.6 REAKTIONSKITS 22
2.7 GERAETE 22
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IMAGE 2
2.7.1. ZENTRIFUGEN 22
2.7.2. ELEKTROPHORESE UND WESTERN BLOT 22
2.7.3. BAKTERIEN UND ZELLKULTUR 23
2.7.4. SONSTIGE GERAETE 23
3 . M E T H O D E N 2 4
3.1 M O L E K U L A R B I O L O G I S C H E M E T H O D E N 24
3.1.1. PCR ZUR AMPLIFIZIERUNG VON KONSTRUKTEN 24
3.1.2. ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA 24
3.1.3. REINIGUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN 25
3.1.4. VERDAU VON DNA DURCH TYP II RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 25
3.1.5. PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION 25
3.1.6. ETHANOLFAELLUNG VON DNA 26
3.1.7. PHOSPHORYLIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN 26
3.1.8. DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 26
3.1.9. LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN IN VEKTOREN 27
3.1.10. HITZESCHOCK-TRANSFORMATION IN KOMPETENTE E. COLI-ZELLEN 27
3.1.11. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 28
3.1.12. DNA-SEQUENZIERUNG 28
3.1.13. ORTSPEZIFISCHE MUTAGENESE 29
3.2 P R O T E I N B I O C H E M I S C H E M E T H O D E N 3 0
3.2.1. ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON PROTEINEN 30
3.2.2. PROTEINFAERBUNG IN SDS-POLYACRYLAMIDGELEN MIT COOMASSIE BRILLIANT
BLUE 31
3.2.3. SILBERFARBUNG VON PROTEINEN IN SDS-POLYACRYLAMIDGELEN 31
3.2.4. ELEKTROTRANSFER VON PROTEINEN AUF PVDF-MEMBRANEN 32
3.2.5. IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS VON PROTEINEN AUF PVDF-MEMBRANEN 33
3.2.6. PROTEINBESTIMMUNG: BCA-ASSAY 33
3.2.7. REKOMBINANTE EXPRESSION VON FUSIONSPROTEINEN IN E. COLI 33
3.2.7.1. GST- UND MBP-GETAGGTE PROTEINE 35
3.2.7.2. HISIS-GETAGGTE PROTEINE (NATIV) 35
3.2.8. DIALYSE VON PROTEINLOESUNGEN 35
3.2.9. IN V/7RO-ASSOZIATION VON MBP- UND GST-FUSIONSPROTEINEN
(PULL-DOWN-ASSAY) 36
3.2.9.1. INTERAKTION VON OCCLUDIN MIT CK1 UND CK1I 36
3.2.9.2. INTERAKTION VON OCCLUDIN MIT ZO-2 IN MDCK-ZELLLYSATEN 37
IMAGE 3
3.2.9.3. INTERAKTION VON OCCLUDIN MIT ZO-1 37
3.2.10. CO-IMMUNPRAEZIPITATION (IP) 37
3.2.10.1. NACHWEIS VON OCCLUDIN- CASEIN-KINASE-KOMPLEXEN IN
HEK-293-ZELLLYSATEN 38
3.2.10.2. NACHWEIS VON OCCLUDIN-ZO-2-KOMPLEXEN IN MDCK-ZELLLYSATEN 38
3.2.11. IN VITRO-PHOSPHORYLIERUNG 38
3.3 Z E L L K U L T U R 39
3.3.1. KULTIVIERUNG VON ZELLEN 39
3.3.2. BESTIMMUNG DER ZELLZAHL IN EINER NEUBAUER-ZAEHLKAMMER 40
3.3.3. EINFRIEREN VON ZELLEN 40
3.3.4. AUFTAUEN VON ZELLEN 40
3.3.5. TRANSIENTE TRANSFEKTION VON ZELLEN 41
3.3.5.1. CALCIUMPHOSPHAT-TRANSFEKTION 41
3.3.5.2. TRANSFEKTION MIT FUGENEHD 41
3.3.5.3. TRANSFEKTION MIT TURBOFECT* 41
3.3.6. STABILE TRANSFEKTION VON ZELLEN 42
3.3.7. LYSE EUKARYOTISCHER ZELLEN 42
3.3.8. INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ 43
3.3.9. CALCIUM-SWITCH-EXPERIMENTE 43
3.3.10. WIDERSTANDSMESSUNGEN 44
3.3.11. PROLIFERATIONSASSAY 45
3.3.12. MALDI 46
4 . ERGEBNISSE 4 7
4.1 INTERAKTION VON OCCLUDIN M I T K I N A S E N 4 7
4.1.1. INTERAKTION VON OCCLUDIN MIT CKI UND CKII 47
4.1.2. DIREKTE INTERAKTION VON OCCLUDIN MIT CKI UND CKII 48
4.2 P H O S P H O R Y L I E R U N G VON OCCLUDIN 50
4.2.1. IDENTIFIZIERUNG VON CKI-PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN 51
4.2.2. IDENTIFIZIERUNG VON CKII-PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN IN OCCLUDIN 53
4.2.3. SERIELLE PHOSPHORYLIERUNG DURCH GSK3SS 55
4.3 C K I I - A B H AE N G I G E INTERAKTION VON O C C L U D I N MIT ZO-1
UND -2 57
4.3.1. DIREKTE INTERAKTION VON OCCLUDIN UND ZO-1 57
4.3.2. CHARAKTERISIERUNG DER OCCLUDIN-ZO-2-INTERAKTION IN MDCK-ZELLEN 59
IMAGE 4
4.4 P H Y S I O L O G I S C H E B E D E U T U N G DER C K I I - A B H AE
N G I G E N
P H O S P H O R Y L I E R U N G 61
4.4.1. EINFLUSS DER CKH-ABHAENGIGEN PHOSPHORYLIERUNG AUF DIE
ASSEMBLIERUNG DER TJS 63
4.4.2. EINFLUSS DER CKH-ABHAENGIGEN PHOSPHORYLIERUNG AUF DIE
BARRIEREEIGENSCHAFTEN
DER TJS 65
4.4.3. EINFLUSS DER CKH-ABHAENGIGEN PHOSPHORYLIERUNG AUF PROLIFERATION 67
5 . DISKUSSION 6 8
5.1 OCCLUDIN I N T E R A G I E R T MIT DEN K I N A S E N C K I UND CKII
68
5.2 CKI P H O S P H O R Y L I E R T OCCLUDIN 69
5.3 C K I I P H O S P H O R Y L I E R T O C C L U D I N AN DEN A M I N O
S AE U R E N T400, T 4 0 4
UND S408 7 0
5.4 P H O S P H O R Y L I E R U N G VON OCCLUDIN D U R C H G S K 3 SS 71
5.5 D I E C K I I - A B H AE N G I G E P H O S P H O R Y L I E R U N G
VON OCCLUDIN M O D U L I E R T
DIE INTERAKTION Z W I S C H E N OCCLUDIN UND DEN Z O - P R O T E I N E N
72
5.5.1. INTERAKTION VON OCCLUDIN UND ZO-2 73
5.5.2. INTERAKTION VON OCCLUDIN UND ZO-1 73
5.6 D I E P H Y S I O L O G I S C H E B E D E U T U N G DER C K I I - A
B H AE N G I G E N
P H O S P H O R Y L I E R U N G VON OCCLUDIN 74
5.6.1. LOKALISATION DER OCCLUDIN-KONSTRUKTE 74
5.6.2. DISSOZIATION UND REASSEMBLIERUNG DER TIGHT JUNCTIONS 75
5.6.3. TRANSEPITHELIALER WIDERSTAND 76
5.6.4. PROLIFERATION 78
6 . ZUSAMMENFASSUNG 8 0
7 . SUMMARY 8 2
8 . L I T E R A T U R 8 4
9 . A N H A N G 9 4
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