Verfügbarkeit: Viren der bovinen Virisdiarrhoe und der klassischen Schweinepest

Viren der bovinen Virisdiarrhoe und der klassischen Schweinepest: Einfluss von Mutationen auf Persistenzentwicklung, Virulenz und Induktion einer Interferonantwort

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Schürmann, Eva-Maria (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
Sprache:	German
Veröffentlicht:	2010
Schlagworte:	cattle dairy cows pigs Classical swine fever virus Bovine viral diarrhea virus 1 Bovine viral diarrhea virus 2 animal viruses virulence mutations persistence Schweinepest-Virus Virusdiarrhoe-Mucosal Disease Mutation Hochschulschrift
Online-Zugang:	Inhaltsverzeichnis
Beschreibung:	266 S. Ill., graph. Darst. 21 cm

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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS DANKSAGUNG ............................................................................................................................. 9 INHALTSVERZEICHNIS ................................................................................................................... 11 1 EINLEITUNG ....................................................................................................................... 19 1.1 PESTIVIREN ...................................................................................................................... 19 1.2 PATHOGENESE VON PESTIVIRUS INDUZIERTEN KRANKHEITEN ............................................ 19 1.2.1 BOVINE VIRUSDIARRHOE ............................................................................................ 20 1.2.2 KLASSISCHE SCHWEINEPEST ................................................................................... 23 1.3 MORPHOLOGIE UND GENOMAUFBAU ................................................................................ 24 1.3.1 NICHTSTRUKTURPROTEIN NPRO ...................................................................................... 26 1.3.2 GLYKOPROTEIN ETS .................................................................................................. 27 1.4 INTERFERON ...................................................................................................................... 28 1.5 ZIELSETZUNG DER ARBEIT ................................................................................................. 29 2 MATERIAL UND METHODEN ............................................................................................... 30 2.1 MATERIAL ........................................................................................................................ 30 2.1.1 ZELLLINIEN ................................................................................................................ 30 2.1.2 VIREN ...................................................................................................................... 31 2.1.2.1 VIREN DER BOVINEN VIRUS DIARRHOE (BVDV) ................................................. 31 2.1.2.2 VIREN DER KLASSISCHEN SCHWEINEPEST (CSFV) ........................................... 32 2.1.3 VERSUCHSTIERE ....................................................................................................... 33 2.1.3.1 SCHWEINE .......................................................................................................33 2.1.3.2 KAELBER ............................................................................................................. 33 2.1.4 NARKOTIKA ...............................................................................................................33 2.1.5 BAKTERIEN ............................................................................................................... 34 2.1.6 REAGENZIEN ...........................................................................................................34 2.1.6.1 CHEMIKALIEN ................................................................................................... 34 2.1.6.2 ANTIKOERPER ...................................................................................................... 37 2.1.6.3 ENZYME ......................................................................................................... 37 2.1.6.4 VORGEFERTIGTE SYSTEME (YYKITS ) ..................................................................... 37 2.1.6.5 VERWENDETE OLIGONUKLEOTIDE ....................................................................... 38 2.1.6.6 VERWENDETE PLASMIDE ..................................................................................38 12 INHALTSVERZEICHNIS 2.1.7 MEDIEN, LOESUNGEN UND PUFFER ............................................................................. 39 2.1.8 VERBRAUCHSMATERIAL .............................................................................................. 42 2.1.9 GERAETE .................................................................................................................... 43 2.2 METHODEN ..................................................................................................................... 45 2.2.1 TIEREXPERIMENTELLE METHODEN .............................................................................. 45 2.2.1.1 VAKZINATION/ INFEKTION .................................................................................. 45 2.2.1.2 BESTIMMUNG DER KLINISCHEN PUNKTZAHL ........................................................ 46 2.2.1.3 KOERPERTEMPERATUR .......................................................................................... 48 2.2.1.4 PROBENNAHME ................................................................................................ 48 2.2.2 METHODEN ZUR ANALYSE DER PROBEN AUS TIEREXPERIMENTEN .............................. 49 2.2.2.1 BESTIMMUNG DER GESAMTLEUKOZYTENZAHL .................................................... 49 2.2.2.2 GEWINNUNG VON YYBUFFY-COAT-PRAEPARATIONEN ............................................... 50 2.2.2.3 AUFARBEITUNG VON ORGANPROBEN ................................................................... 50 2.2.2.4 KULTIVIERUNG VON ZELLEN .................................................................................50 2.2.2.5 VIRUSNACHWEIS AUS PROBENMATERIAL DURCH ANZUECHTUNG IN ZELLKULTUREN.. 52 2.2.2.6 NACHWEIS NEUTRALISIERENDER ANTIKOERPER - SERUMNEUTRALISATIONSTEST ....... 53 2.2.2.7 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ (IF) .................................................................. 54 2.2.2.8 ELISA ZUM NACHWEIS VON BVDV-ANTIGEN UND BVDV-ANTIKOERPERN ........ 55 2.2.2.9 DURCHFLUSSZYTOMETRIE .................................................................................... 56 2.2.2.10 MX-CAT-REPORTER-GEN-ASSAY: IFN-NACHWEIS IM PLASMA ..................... 56 2.2.3 METHODEN ZUR CHARAKTERISIERUNG DER VERWENDETEN VIREN ................................ 57 2.2.3.1 INFEKTION VON ZELLEN .......................................................................................57 2.2.3.2 VIRUSTITRATION UND TITERBERECHNUNG ..............................................................58 2.2.3.3 WACHSTUMSKURVEN ......................................................................................... 58 2.2.3.4 RNA-EXTRAKTION AUS ZELLEN ........................................................................... 59 2.2.3.5 REVERSE TRANSKRIPTASE-POLYMERASE-KETTENREAKTION (RT-PCR) ............... 59 2.2.3.6 SEQUENZIERUNG ..............................................................................................59 2.2.3.7 BESTIMMUNG DER RIBONUKLEASE-AKTIVITAET (RNASE-TEST) ............................ 60 2.2.3.8 MX-CAT-REPORTER-GEN-ASSAY: IFN-PRODUKTION IN ZELLKULTUREN NACH VIRUSINFEKTION ................................... 61 2.2.4 METHODEN ZUR GENERIERUNG NEUER VIRUSMUTANTEN ............................................ 61 2.2.4.1 AGAROSEGELELEKTROPHORESE ............................................................................ 61 2.2.4.2 AUFREINIGUNG DER DNA ................................................................................... 61 2.2.4.3 RESTRIKTIONSENZYMSPALTUNG ........................................................................... 61 INHALTSVERZEICHNIS 13 2.2.4.4 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN ZUR HERSTELLUNG NEUER PLASMIDE ...........62 2.2.4.5 HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN .................................................................. 62 2.2.4.6 HITZESCHOCKTRANSFORMATION VON E. COLI ....................................................... 62 2.2.4.7 PLASMID-DNA-PRAEPARATION ........................................................................... 63 2.2.4.8 PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION ZUR AUFREINIGUNG DER DNA / RNA ........... 63 2.2.4.9 IN VITRO-TRANSKRIPTION ..................................................................................... 64 2.2.4.10 FORMALDEHYD-AGAROSE-GELE ...................................................................... 64 2.2.4.11 ELEKTROPORATION VON ZELLEN MIT RNA ......................................................... 65 3 ERGEBNISSE .....................................................................................................................66 3.1 BVDV-DOPPELMUTANTE: GRUNDLAGENUNTERSUCHUNGEN ........................................66 3.1.1 SICHERHEITSSTUDIE 1 (BOS BIVI 021) .................................................................... 66 3.1.1.1 RUECKTITRATION DER VAKZINEVIREN ..................................................................... 67 3.1.1.2 ANALYSE DER YYBUFFY-COAT -PRAEPARATIONEN ..................................................... 67 3.1.1.3 POSTMORTALE UNTERSUCHUNG DER FETALEN ORGANE ......................................... 68 3.1.1.4 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNG (SNT) ............................................................. 69 3.1.1.5 ZUSAMMENFASSUNG SICHERHEITSSTUDIE 1 (B05 BIVI 021) ........................... 71 3.1.2 SICHERHEITSSTUDIE 2 (B05 BIVI 022 / FK610) ....................................................... 72 3.1.2.1 RUECKTITRATION DER VAKZINEVIREN .....................................................................72 3.1.2.2 ANALYSE DER YYBUFFY-COAT -PRAEPARATIONEN ..................................................... 73 3.1.2.3 POSTMORTALE UNTERSUCHUNG DER FETALEN ORGANE .........................................73 3.1.2.4 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNG (SNT) .............................................................73 3.1.2.5 ZUSAMMENFASSUNG SICHERHEITSSTUDIE 2 (B05 BIVI 022 / FK610) .............. 74 3.1.3 INTRAUTERINE INFEKTION 1 (COMPTON 06/1) ............................................................ 75 3.1.3.1 ANALYSE DER YYBUFFY-COAT -PRAEPARATIONEN ..................................................... 76 3.1.3.2 POSTMORTALE UNTERSUCHUNG DER FETALEN ORGANE .........................................77 3.1.3.3 BESTIMMUNG VON TYP1-INTERFERON IN FETALEM UND MATERNALEM SERUM....79 3.1.3.4 NACHWEIS VON MX ......................................................................................... 82 3.1.3.5 ZUSAMMENFASSUNG INTRAUTERINE INFEKTION 1 (COMPTON 06/1) ...................83 3.1.4 INTRAUTERINE INFEKTION 2 (COMPTON 06/2) ............................................................84 3.1.4.1 POSTMORTALE UNTERSUCHUNG DER FETALEN ORGANE .........................................84 3.1.4.2 ZUSAMMENFASSUNG INTRAUTERINE INFEKTION 2 (COMPTON 07/3) ................... 85 3.1.5 INTRAUTERINE INFEKTION 3 (COMPTON 07/3) ............................................................86 3.1.5.1 UEBERSICHT ZUM VERSUCHSVERLAUF .................................................................. 86 3.1.5.2 ANALYSE DER YYBUFFY-COAT -PRAEPARATIONEN .................................................... 87 14 INHALTSVERZEICHNIS 3.1.5.3 POSTMORTALE UNTERSUCHUNG DER FETALEN ORGANE ......................................... 88 3.1.5.4 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNG (SNT) .............................................................89 3.1.5.5 ZUSAMMENFASSUNG INTRAUTERINE INFEKTION 3 (COMPTON 07/3) ................... 90 3.1.6 IN-VITRO-UNTERSUCHUNGEN ZUM INTERFERON-NACHWEIS ........................................ 91 3.1.6.1 ZEITLICHER VERLAUF DER IFN-KONZENTRATION IN ZELLKULTURUEBERSTAENDEN ........ 91 3.1.6.2 UNTERSUCHUNG VON ZELLKULTUREN AUF IHRE FAEHIGKEIT ZUR IFN-PRODUKTION .. 92 3.1.6.3 ZUSAMMENFASSUNG: IN-VITRO UNTERSUCHUNGEN INTERFERON-NACHWEIS ...... 96 3.2 BVDV-DOPPELMUTANTE: PATHOGENESE / DISSEMINATION / TRANSMISSION (UNTERSUCHUNGEN IN JUNGTIEREN) ............................................................................ 97 3.2.1 SICHERHEITSSTUDIE YYKALB -TUEBINGEN (TV#24) ..................................................... 97 3.2.1.1 ZEITPLAN ........................................................................................................... 98 3.2.1.2 AUSWAHL UND BEZEICHNUNG DER TIERE .......................................................... 99 3.2.1.3 VAKZINATION UND TITRATION DES VAKZINEVIRUS ............................................. 100 3.2.1.4 KLINISCHE BEOBACHTUNGEN ........................................................................... 102 3.2.1.5 KOERPERTEMPERATUR ........................................................................................103 3.2.1.6 LEUKOZYTENZAEHLUNG ......................................................................................104 3.2.1.7 ANALYSE DER YYBUFFY-COAT -PRAEPARATIONEN ....................................................106 3.2.1.8 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNG (SNT) ............................................................ 106 3.2.1.9 POSTMORTALE UNTERSUCHUNG DER ORGANE ....................................................107 3.2.1.10 ZUSAMMENFASSUNG SICHERHEITSSTUDIE YYKALB - TUEBINGEN (TV#24) .... 108 3.2.2 DISSEMINATIONS UND TRANSMISSIONSSTUDIE (2007098) ................................... 110 3.2.2.1 RUECKTITRATION DER VAKZINEVIREN ................................................................... 110 3.2.2.2 ANALYSE DER YYBUFFY-COAT -PRAEPARATIONEN ................................................... 112 3.2.2.3 ANALYSE DER NASENTUPFER ........................................................................... 112 3.2.2.4 POSTMORTALE UNTERSUCHUNG DER ORGANE .................................................... 112 3.2.2.5 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNG (SNT) ..........................................................117 3.2.2.6 ZUSAMMENFASSUNG DISSEMINATIONS UND TRANSMISSIONSSTUDIE ...........119 3.2.3 DISSEMINATIONSSTUDIE TUEBINGEN (2008040) .................................................... 120 3.2.3.1 ZEITPLAN ......................................................................................................... 120 3.2.3.2 AUSWAHL, BEZEICHNUNG UND BEHANDLUNG DER TIERE ................................... 121 3.2.3.3 VAKZINATION UND TITRATION DER VAKZINEVIREN ............................................... 123 3.2.3.4 KLINISCHE BEOBACHTUNG ...............................................................................126 3.2.3.5 KOERPERTEMPERATUR ........................................................................................ 128 3.2.3.6 LEUKOZYTENZAEHLUNG ......................................................................................129 INHALTSVERZEICHNIS 15 3.2.3.7 ANALYSE DER YYBUFFY-COAT -PRAEPARATIONEN .................................................129 3.2.3.8 POSTMORTALE UNTERSUCHUNG DER ORGANE .................................................. 130 3.2.3.9 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNG (SNT) ........................................................... 132 3.2.3.10 ZUSAMMENFASSUNG DISSEMINATIONSSTUDIE TUEBINGEN (2008040) ........ 132 3.2.4 MILCHSTUDIE (2007134) ........................................................................................ 134 3.2.4.1 RUECKTITRATION DER VAKZINEVIREN ................................................................... 135 3.2.4.2 ANALYSE DER YYBUFFY-COAT -PRAEPARATIONEN ................................................... 136 3.2.4.3 ANALYSE DER NASENTUPFER ............................................................................ 137 3.2.4.4 ANALYSE DER MILCHPELLETS ............................................................................. 137 3.2.4.5 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNG (SNT) ........................................................... 138 3.2.4.6 ZUSAMMENFASSUNG MILCHSTUDIE (2007134) .............................................140 3.3 BVDV-DOPPELMUTANTE: SPEZIFISCHE STUDIEN ZUM EINSATZ ALS IMPFSTOFF ............................................... 142 3.3.1 EFFIZIENZSTUDIE 1 (BOS BIVI 022) ...................................................................... 142 3.3.1.1 RUECKTITRATION DER VIREN FUER VAKZINATION UND BELASTUNGSINFEKTION .......... 143 3.3.1.2 ANALYSE DER YYBUFFY-COAT-PRAEPARATIONEN ................................................... 144 3.3.1.3 POSTMORTALE UNTERSUCHUNG DER FETALEN ORGANE ....................................... 145 3.3.1.4 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNG (SNT) ........................................................... 146 3.3.1.5 ZUSAMMENFASSUNG EFFIZIENZSTUDIE 1 (B05 BIVI 022) ............................. 148 3.3.2 EFFIZIENZSTUDIE 2 (BOS BIVI 022 / FK604) ........................................................ 149 3.3.2.1 RUECKTITRATION DER VIREN FUER DIE BELASTUNGSINFEKTION ................................ 149 3.3.2.2 ANALYSE DER YYBUFFY-COAT -PRAEPARATIONEN ................................................... 150 3.3.2.3 POSTMORTALE UNTERSUCHUNG DER FETALEN ORGANE ....................................... 150 3.3.2.4 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNG (SNT) .......................................................... 151 3.3.2.5 ZUSAMMENFASSUNG EFFIZIENZSTUDIE 2 (B05 BIVI 022 /FK604) ................. 153 3.3.3 VORLAEUFIGE DOSISFINDUNGSSTUDIE (2008010) .................................................... 154 3.3.3.1 RUECKTITRATION DER VIREN FUER VAKZINATION UND BELASTUNGSINFEKTION .......... 155 3.3.3.2 POSTMORTALE UNTERSUCHUNG DER FETALEN ORGANE ....................................... 156 3.3.3.3 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNG (SNT) ........................................................... 159 I) ERGEBNISSE SNT - DURCHGANG 1 ......................................................................... 159 II) ERGEBNISSE SNT - DURCHGANG 2 ........................................................................ 162 III) ERGEBNISSE SNT - NICHT TRAGENDE TIERE ........................................................... 165 3.3.3.4 ZUSAMMENFASSUNG VORLAEUFIGE DOSISFINDUNGSSTUDIE (2008010) ............. 167 16 INHALTSVERZEICHNIS 3.4 CSFV: NP UND RNASE-NEGATIVE MUTANTE ......................................................... 168 3.4.1 HERSTELLUNG EINER CSFV-DOPPELMUTANTE .......................................................... 168 3.4.1.1 CSFV-DOPPELMUTANTE - ANSATZ 1 ..............................................................168 3.4.1.2 CSFV-DOPPELMUTANTE - ANSATZ 2 .............................................................. 170 3.4.1.3 RUECKKLONIERUNG AUF EINZELMUTANTE - ANSATZ 3 ......................................... 171 3.4.1.4 KONTROLLE DES RUECKGRATES DES GESAMTKLONS 1347 - ANSATZ 4 ...............172 3.4.1. 5 VERGLEICH DER WACHSTUMSEIGENSCHAFTEN ..................................................174 3.5 CSFV: DIMERISIERUNG DES ERNS-PROTEINS (TIEREXPERIMENTE) ............................175 3.5.1 DIMERISIERUNGSNEGATIVE MUTANTE I (TV#25) .....................................................175 3.5.1.1 CHARAKTERISIERUNG DER IM TV#25 EINGESETZTEN VIREN .............................. 176 3.5.1.2 AUSWAHL UND BEZEICHNUNG DER TIERE ........................................................ 177 3.5.1.3 ZEITPLAN ......................................................................................................... 177 3.5.1.4 INFEKTION UND TITRATION DER VIREN ................................................................179 3.5.1.5 KLINISCHE PUNKTZAHL ..................................................................................... 180 3.5.1.6 KOERPERTEMPERATUR ........................................................................................ 181 3.5.1.7 LEUKOZYTENZAEHLUNG ...................................................................................... 183 3.5.1.8 ANALYSE DER YYBUFFY-COAT -PRAEPARATIONEN ....................................................185 3.5.1.9 NACHWEIS VON INTERFERON IM PLASMA .......................................................... 185 3.5.1.10 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNG (SNT) .......................................................... 186 3.5.1.11 ANALYSE DER REISOLIERTEN VIREN .................................................................. 187 3.5.1.12 ZUSAMMENFASSUNG TV#25 ...................................................................... 190 3.5.2 DIMERISIERUNGSNEGATIVE MUTANTE II (TV#26) .................................................... 191 3.5.2.1 CHARAKTERISIERUNG DER IM TV#26 EINGESETZTEN VIREN .............................. 191 3.5.2.2 AUSWAHL UND BEZEICHNUNG DER TIERE ........................................................ 193 3.5.2.3 ZEITPLAN ......................................................................................................... 193 3.5.2.4 INFEKTION UND TITRATION DER VIREN ................................................................ 194 3.5.2.5 KLINISCHE PUNKTZAHL ..................................................................................... 195 3.5.2.6 KOERPERTEMPERATUR ........................................................................................196 3.5.2.7 LEUKOZYTENZAEHLUNG ...................................................................................... 198 3.5.2.8 ANALYSE DER YYBUFFY-COAT-PRAEPARATIONEN .................................................... 200 3.5.2.9 FACS-ANALYSE ............................................................................................. 201 3.5.2.10 NACHWEIS VON INTERFERON IM PLASMA ....................................................... 201 3.5.2.11 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNG (SNT) ......................................................... 202 3.5.2.12 ANALYSE DER REISOLIERTEN VIREN .................................................................. 203 INHALTSVERZEICHNIS 17 3.5.2.13 ZUSAMMENFASSUNG TV#26 ...................................................................... 204 3.5.3 DIMERISIERUNGSNEGATIVE MUTANTE III (TV#27) ................................................. 205 3.5.3.1 CHARAKTERISIERUNG DER IM TV#27 EINGESETZTEN VIREN .............................. 205 3.5.3.2 AUSWAHL UND BEZEICHNUNG DER TIERE ........................................................ 207 3.5.3.3 ZEITPLAN ......................................................................................................... 207 3.5.3.4 INFEKTION UND TITRATION DER VIREN ............................................................... 208 3.5.3.5 KLINISCHE PUNKTZAHL .................................................................................... 209 3.5.3.6 KOERPERTEMPERATUR ....................................................................................... 210 3.5.3.7 LEUKOZYTENZAEHLUNG .................................................................................... 212 3.5.3.8 ANALYSE DER YYBUFFY-COAT -PRAEPARATIONEN .................................................. 213 3.5.3.9 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNG (SNT) ........................................................... 214 3.5.3.10 ANALYSE DER REISOLIERTEN VIREN ................................................................ 215 3.5.3.11 ZUSAMMENFASSUNG TV#27 ...................................................................... 215 4 DISKUSSION .................................................................................................................. 216 4.1 DIE BVDV-DOPPELMUTANTE WIRD NICHT AUF DEN FETUS UEBERTRAGEN ........................ 219 4.2 DAS IMPFVIRUS VERBREITET SICH NUR BEGRENZT IM TIERKOERPER UND WIRD NICHT AUF KONTAKTTIERE UEBERTRAGEN ........................................................................................... 226 4.3 FETEN GEIMPFTER MUTTERTIERE SIND VOR EINER BVDV-WILDTYPINFEKTION GESCHUETZT... 230 4.4 KOMBINATION VON NPRO UND RNASE-DELETIONEN IM VIRUS DER KLASSISCHEN SCHWEINEPEST ...................................................................................... 232 4.5 DIE AUSSCHALTUNG DER E MS -DIMERISIERUNG FUEHRT ZUR ATTENUIERUNG VON CSFV .... 233 ZUSAMMENFASSUNG .............................................................................................................. 239 SUMMARY .............................................................................................................................. 241 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................................. 243 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS ...................................................................................................... 255 ABBILDUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................................... 260 TABELLENVERZEICHNIS ........................................................................................................... 263 ERKLAERUNG .............................................................................................................................. 267
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