Strategien der quantitativen Phosphoproteomik zur Signaltransduktionsanalyse von Kinasen:
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 PROTEINKINASEN UND PHOSPHORYLIERUNG 1
1.2 MITOTISCHE KINASEN 3
1.2.1 PHASEN UND PRINZIPIEN DER MITOSE 3
1.2.2 DIE MITOTISCHE SERIN-/THREONINKINASE PLKL 4
1.2.3 DIE MITOTISCHE SERIN-/THREONIN-/ TYROSINKINASE M P S L 12
1.3 PROTEINKINASEN UND KREBS 16
1.3.1 NICHT-KLEINZELLIGES LUNGENKARZINOM 17
1.4 MASSENSPEKTROMETRIE 19
1.4.1 MASSENSPEKTROMETRIE UND PHOSPHOPROTEOMIK 19
1.4.2 QUANTITATIVE MASSENSPEKTROMETRIE 25
1.5 IDENTIFIKATION VON KINASESUBSTRATEN 27
1.6 AUFGABENSTELLUNG 3 1
2 MATERIAL UND METHODEN 32
2.1 MATERIAL 32
2.1.1 GERAETE 32
2.1.2 VERBRAUCHSMATERIAL 33
2.1.3 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 33
2.1.4 PUFFER 36
2.1.5 ZELLLINIEN 36
2.1.6 SOFTWARE UND ONLINEDIENSTE 37
2.2 ZELLKULTUR UND SILAC MARKIERUNG 38
2.2.1 KULTIVIERUNG VON HTERT-RPE ZELLEN 38
2.2.2 KULTIVIERUNG VON NSCLC ZELLLINIEN 40
2.3 SDS-POLYACRYLAMID GELELECTROPHORESE UND IMMUNOBLOTTING 4 1
2.4 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 42
2.5 KINASEASSAY 43
2.6 PROBENVORBEREITUNG FUER DIE MASSENSPEKTROMETRIE 43
2.6.1 PROTEINVERDAU IN LOESUNG 43
2.6.2 PEPTIDENTSALZUNG MIT C18 KARTUSCHEN 44
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IMAGE 2
2.6.3 PEPTIDFRAKTIONIERUNG MIT SCX CHROMATOGRAPHIE 44
2.6.4 PHOSPHOPEPTIDANREICHERUNG MIT IMAC 45
2.6.5 PROBEN ZUR BESTIMMUNG DES POOLINGFEHLERS UND DER
MARKIERUNGSEFFIZIENZ. 45
2.7 MASSENSPEKTROMETRISCHE ANALYSE 46
2.8 PROZESSIERUNG DER MASSENSPEKTROMETRISCHEN DATEN 46
2.8.1 PLKL UND M P S L STUDIE 48
2.8.2 NSCLC STUDIE 50
2.9 BIOINFORMATISCHE AUSWERTUNG 5 1
2.9.1 PLKL UND M P S L STUDIE 5 1
2.9.2 NSCLC STUDIE 52
3 ERGEBNISSE 53
3.1 PLKL SUBSTRATIDENTIFIKATIONSSTUDIE 53
3.1.1 OPTIMIERUNG DER SYNCHRONISATION DER ZELLEN 53
3.1.2 BESTIMMUNG DER OPTIMALEN INHIBITORKONZENTRATION 55
3.1.3 FESTLEGUNG DES INHIBITIONSSCHEMAS 55
3.1.4 DURCHFUEHRUNG DES MASSENSPEKTROMETRIEEXPERIMENTS 57
3.1.5 MASSENSPEKTROMETRISCHE IDENTIFIKATIONEN 58
3.1.6 STATISTISCHE ANALYSE MIT SAM 63
3.1.7 BIOINFORMATISCHE ANALYSE DER PLKL REGULIERTEN PHOSPHOPEPTIDE UND
PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN 67
3.2 M P S L SUBSTRATIDENTIFIKATIONSSTUDIE 74
3.2.1 FESTLEGUNG DES INHIBITIONSSCHEMAS 74
3.2.2 DURCHFUEHRUNG DES MASSENSPEKTROMETRIEEXPERIMENTS 76
3.2.3 MASSENSPEKTROMETRISCHE IDENTIFIKATIONEN 77
3.2.4 STATISTISCHE ANALYSE MIT SAM 83
3.2.5 ANALYSE DER M P S L REGULIERTEN PHOSPHOPEPTIDE UND
PHOSPHORYLIERUNGS
STELLEN 87
3.3 ANALYSE DER PHOSPHOSIGNATUREN UNBEHANDELTER NSCLC ZELLLINIEN 90
3.3.1 DURCHFUEHRUNG DER STUDIE 90
3.3.2 MASSENSPEKTROMETRISCHE IDENTIFIKATIONEN 96
3.3.3 CLUSTER ANALYSE DER PHOSPHORYLIERUNGSPROFILE 103
4 DISKUSSION 106
IMAGE 3
4.1 SUBSTRATIDENTIFIKATIONSSTUDIEN DER MITOTISCHEN KINASEN PLKL UND M P
S L 106
4.1.1 PLKL STUDIE 109
4.1.2 M P S L STUDIE 121
4.2 PHOSPHOSIGNATUREN UNBEHANDELTER NSCLC ZELLLINIEN 132
5 ZUSAMMENFASSUNG 134
6 LITERATURVERZEICHNIS 136
7 ANHANG 150
7.1 ALLGEMEINE ABKUERZUNGEN 150
7.2 VERZEICHNIS VERWENDETER PROTEINNAMENABKUERZUNGEN 151
7.3 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 153
7.4 TABELLENVERZEICHNIS 154
7.5 VERZEICHNIS ERGAENZENDER TABELLEN (MS EXCEL FORMAT) 155
8 PUBLIKATIONEN 156
9 DANKSAGUNG 157
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