Einzelmolekül-Fluoreszenzmessungen an der Proteintranslokase Toc34:
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG XI
1 EINLEITUNG 1
1.1 PROTEINIMPORT IN CHLOROPLASTEN 1
1.2 TOC-KOMPLEX 3
1.3 GTPASEN 4
1.4 TOC GTPASE ZYKLUS 5
2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN 7
2.1 FLUORESZENZ 8
2.1.1 ENERGIEUEBERGAENGE IM MOLEKUEL 8
2.1.2 FLUORESZENZFAEHIGE MOLEKUELE - FLUOROPHORE 9
2.1.3 ABSORPTION UND EMISSION 9
2.1.4 QUANTENAUSBEUTE UND LEBENSDAUER 11
2.2 FLUORESZENZANISOTROPIE 11
2.2.1 DEFINITION DER ANISOTROPIE 11
2.2.2 THEORIE DER ANISOTROPIE 12
2.3 FLUORESZENZ RESONANZENERGIETRANSFER (FRET) 14
2.3.1 THEORIE ZUM FRET 14
2.3.2 THEORIE ZUR BESTIMMUNG DER FRET-EFFIZIENZ AUS MESSDATEN 17
3 MATERIAL UND METHODEN 19
3.1 CY STEINMUTANTEN 20
3.1.1 LOKALE PROTEINKONZENTRATION DES SPACER-ZIPPER KONSTRUKTS 20
3.2 FARBSTOFFE 21
3.3 TRANSITPEPTID 22
3.4 ALUMINIUMFLUORID 23
I
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IMAGE 2
INH AL TS VERZEI CHNIS
3.5 BIOCHEMISCHE METHODEN 23
3.5.1 VERWENDETE PUFFER 23
3.5.2 EXPRESSION UND ZELLAUFSCHLUSS 24
3.5.3 PROTEINAUFREINIGUNG 25
3.5.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 25
3.5.5 FLUORESZENZMARKIEREN DER PROTEINE 26
3.5.6 OBERFLAECHENIMMOBILISIERUNG 26
3.6 HERSTELLEN DER FLUSSKAMMERN 27
3.6.1 ZUSCHNEIDEN VON DECKGLAESCHEN UND NESCOFILM 27
3.6.2 REINIGUNG DER DECKGLAESCHEN 28
3.6.3 SILANISIERUNG DER OBERFLAECHEN 29
3.6.4 FUNKTIONALISIERUNG DER OBERFLAECHEN 29
3.6.5 ZUSAMMENBAU DER FLUSSKAMMER 30
3.6.6 FLUSSKAMMER IM VERSUCHSAUFBAU 30
3.7 FLUORESZENZSPEKTROMETER 31
3.8 CIS-TOTALREFLEXIONSFLUORESZENZMIKROSKOP - TIRFM 33
3.8.1 ANREGUNGSSTRAHLENGANG 34
3.8.2 DETEKTIONSSTRAHLENGANG 36
3.8.3 DURCHFUEHRUNG DER EINZELMOLEKUELMESSUNGEN 36
3.8.4 AUSWERTUNG 37
3.8.5 BESTIMMUNG DES GAMMA-FAKTORS 38
3.9 BERECHNUNG VON ASSOZIATIONSRATEN 39
3.10 BERECHNUNG VON DISSOZIATIONSKONSTANTEN 40
4 MESSERGEBNISSE 41
4.1 STRUKTUR DES PSTOC34 HOMODIMERS 41
4.1.1 FRET-MESSUNGEN AN DEN CYSTEINMUTANTEN DES /TOC34 HOMODIMERS 42
4.1.2 EINFLUSS DES ARGININFLNGERS AUF DIE STRUKTUR DES /TOC34
HOMODIMERS 47
4.2 EINFLUSS DER NUKLEOTIDE AUF DIE STRUKTUR DES PSTOC3A HOMODIMERS 50
4.3 EINFLUSS DES TRANSITPEPTIDS AUF DIE STRUKTUR DES /?.STOC34
HOMODIMERS . . . . 54
4.4 EINFLUSS DER NUKLEOTIDE AUF DIE BINDUNG DES TRANSITPEPTIDS 61
4.5 ENSEMBLE FRET-MESSUNG AM /TOC34-TOC 159 HETERODIMER 64
LI
IMAGE 3
INHAL TS VERZEICHNI S
5 DISKUSSION
5.1 EIN AKTUELLES MODELL ZUM PROTEINIMPORT 5.2 MONOMER ODER DIMER, DAS
IST HIER DIE FRAGE
5.3 EINFLUSS DER NUKLEOTIDE AUF TOC34 HOMODIMERE
5.4 NUKLEOTIDAUSTAUSCH AM MONOMER ODER DIMER?
5.5 BINDEN DES TRANSITPEPTIDS MIT ANSCHLIESSENDER DISSOZIATION DES TOC34
HOMODIMERS
5.6 HETERODIMER
5.7 ZUSAMMENFASSUNG
6 AUSBLICK
6.1 UEBERGANGSZUSTAND 6.2 HETERODIMER
6.3 MAGNETISCHE PINZETTE
LITERATURVERZEICHNIS
67
67 68
70
71
72
75
76
81
81 82
83
85
III
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