Charakterisierung der Nichtstrukturproteine des Virus der klassischen Schweinepest:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
Gießen
VVB Laufersweiler
2011
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Ausgabe: | 1. Aufl. |
Schriftenreihe: | Edition scientifique
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1. INHALTSVERZEICHNIS
1. INHALTSVERZEICHNIS
1. INHALTSVERZEICHNIS I
2. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS IV
3. EINLEITUNG 1
3.1 DIE FAMILIE FLAVIVIRIDAE 1
3.2 DAS GENUS PESTIVIRUS 1
3.3 PESTIVIRALE ERKRANKUNGEN 4
3.4 PESTIVIRALE BIOTYPEN 7
3.5 PESTIVIRALE STRUKTURPROTEINE 9
3.6 PESTIVIRALE NICHTSTRUKTURPROTEINE 12
3.7 NICHTSTRUKTURPROTEINE DES HEPATITIS C VIRUS 14
3.8 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 15
4. MATERIAL UND METHODEN 16
4.1 MATERIAL 16
4.1.1 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 16
4.1.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN 17
4.1.3 GERAETE 18
4.1.4 ENZYME 19
4.1.5 KITS 19
4.1.6 ANTIKOERPER 20
4.1.6.1 PRIMAERANTIKOERPER 20
4.1.6.2 SEKUNDAERANTIKOERPER 20
4.1.7 BASIS-PLASMIDE 21
4.1.8 PESTIVIRALE GENOME ALS CDNS-KLONE 21
4.1.9 PESTIVIRALE REPLIKONS ALS CDNS-KLONE 21
4.1.10 PROKARYOTISCHE ZELLEN 22
4.1.11 EUKARYOTISCHE ZELLEN 22
4.1.12 VIREN 22
4.1.13 MEDIEN, LOESUNGEN UND PUFFER 22
4.2 METHODEN 27
4.2.1 ARBEITEN MIT DNS UND RNS 27
4.2.1.1 HERSTELLUNG UND TRANSFORMATION KOMPETENTER BAKTERIEN 27
4.2.1.2 TRANSFORMATION IN E. COLI 27
4.2.1.3 PRAEPARATION VON PLASMID-DNS AUS BAKTERIENKULTUREN 28
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/1016235534
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
1. INHALTSVERZEICHNIS
4.2.1.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNS UND RNS 29
4.2.1.5 PHENOL-CHLOROFORM EXTRAKTION VON DNS UND RNS 29
4.2.1.6 PRAEZIPITATION VON DNS MIT ETHANOL 30
4.2.1.7 RESTRIKTIONSENZYMVERDAU UND KLONIERUNGSTECHNIKEN 30
4.2.1.8 AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE VON DNS UND RNS 31
4.2.1.9 REINIGUNG VON DNS-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 32
4.2.1.10 LIGATION VON DNS-FRAGMENTEN 33
4.2.1.11 PCR, RT-PCR UND KLONIERUNG VON PCR-FRAGMENTEN 34
4.2.1.12 GERICHTETE MUTAGENESE 38
4.2.1.13 SEQUENZIERUNG UND AUSWERTUNG DER SEQUENZEN 39
4.2.1.14 IN VITRO TRANSKRIPTION 41
4.2.1.15 GEWINNUNG VON GESAMT-RNS MITTELS RNEASY-KIT 42
4.2.1.16 SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE 42
4.2.1.17 KLONIERUNG DER PLASMIDE ZUR EXPRESSION DER PESTIVIRALEN
NICHTSTRUKTURPROTEINE 43
4.2.1.18 GENERIERUNG EINES KSPV REPLIKONS 46
4.2.1.19 GENERIERUNG EINES KSPV REPLIKONS UND EINES KSPV
GESAMTKLONS MIT EINEM METHIONIN IM NS4A 46
4.2.2 ARBEITEN MIT ZELLEN 47
4.2.2.1 ALLGEMEINE ZELLKULTUR-TECHNIKEN 47
4.2.2.2 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 48
4.2.2.3 ELEKTROPORATION VON RNS IN SK6-ZELLEN 48
4.2.2.4 INFEKTION VON SK6-ZELLEN 49
4.2.2.5 BESTIMMUNG DES VIRUSTITERS VON ZELLKULTURUEBERSTAENDEN 49
4.2.2.6 INDIREKTER IMMUNPEROXIDASE TEST 50
4.2.2.7 INDIREKTER IMMUNFLUORESZENZ TEST 51
4.2.2.8 METABOLISCHE MARKIERUNG VIRALER PROTEINE MIT S 35 52
4.2.3 ARBEITEN MIT PROTEINEN 53
4.2.3.1 RADIOIMMUNPRAEZIPITATION 53
4.2.3.2 SDS-PAGE, AUTORADIOGRAPHIE 54
4.2.3.3 WESTERN BLOT (WET) 56
4.2.3.4 PROTEINEXPRESSION IN E. COLI 57
4.2.3.5 AFFINITAETSREINIGUNG VON HIS-TAG-PROTEINEN 58
4.2.3.6 BESTIMMUNG VON PROTEINKONZENTRATIONEN 59
IMAGE 3
1. INHALTSVERZEICHNIS
4.2.3.7 ISOTYPISIERUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER 60
4.2.4 HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER 61
4.2.4.1 IMMUNISIERUNG VON MAEUSEN 61
4.2.4.2 PRAEPARATION VON PERITONEAL-ZELLEN 61
4.2.4.3 PRAEPARATION VON SPLENOCYTEN 62
4.2.4.4 ZELLFUSION UND AUSSAAT DER HYBRIDOMA-ZELLEN 63
4.2.4.5 SELEKTION DER HYBRIDOMA-ZELLEN 64
4.2.4.6 ELISA ZUR DETEKTION MONOKLONALER ANTIKOERPER 65
4.2.4.7 KLONIERUNG UND STABILISIERUNG DER HYBRIDOMA-KLONE 67
4.2.4.8 PRODUKTION MONOKLONALER ANTIKOERPER 68
5. ERGEBNISSE 69
5.1 HERSTELLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN GEGEN KSPV NS2 69
5.1.1 KLONIERUNG UND EXPRESSION EINES GST-NS2-3P-FUSIONSPROTEINS,
EINES GST-GFP-FUSIONSPROTEINS UND VON NS3 69
5.1.2 REINIGUNG DES GST-NS2-3P-FUSIONSPROTEINS 70
5.1.3 PRAEPARATION VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN GEGEN GST-NS2-NS3P 72
5.2 HERSTELLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN GEGEN EIN C-TERMINALES
FRAGMENT DER HELIKASE VON KSPV NS3 75
5.2.1 KLONIERUNG UND EXPRESSION DES C-TERM. NS3-HELIKASE-FRAGMENTS 75
5.2.2 REINIGUNG DES C-TERMINALEN NS3-HELIKASE-FRAGMENTS 77
5.2.3 PRAEPARATION VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN GEGEN DAS C-TERMINALE
NS3-HELIKASE-FRAGMENT 79
5.3 HERSTELLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN GEGEN KSPV NS4B 81
KLONIERUNG UND EXPRESSION EINES C-TERMINALEN NS4B-FRAGMENTS 82
5.3.1 REINIGUNG DES C-TERMINALEN NS4B-FRAGMENTS 83
5.3.2 PRAEPARATION VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN GEGEN DAS C-TERMINALE
NS4B-FRAGMENT 86
5.4 HERSTELLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN GEGEN KSPV NS5A 88
5.4.1 KLONIERUNG UND EXPRESSION VON NS5A 88
5.4.2 REINIGUNG VON NS5A 89
5.4.3 PRAEPARATION VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN GEGEN NS5A 91
5.5 CHARAKTERISIERUNG DER MONOKLONALEN ANTIKOERPER GEGEN DIE
NICHTSTRUKTURPROTEINE DES KSPV IN DER IMMUNFLUORESZENZ 93
5.6 IDENTIFIZIERUNG DER NICHTSTRUKTURPROTEINE DES KSPV IM IMMUNOBLOT 94
M
IMAGE 4
1. INHALTSVERZEICHNIS
5.6.1 IDENTIFIZIERUNG DER NICHTSTRUKTURPROTEINE EINES ZP KSPV REPLIKONS
IN IMMUNOBLOT-ANALYSEN 96
5.6.2 IDENTIFIZIERUNG DER NICHTSTRUKTURPROTEINE EINES NZP KSPV IN
IMMUNOBLOT-ANALYSEN INFIZIERTER SK-6 ZELLEN 98
5.7 CHARAKTERISIERUNG DER NICHTSTRUKTURPROTEINE DES KSPV IM
RADIOIMMUNPRAEZIPITATIONS-ASSAY 100
5.7.1 CHARAKTERISIERUNG DER NICHTSTRUKTURPROTEINE EINES ZP KSPV
REPLIKONS IM RADIOIMMUNPRAEZIPITATIONS-ASSAY 100
5.7.2 CHARAKTERISIERUNG DER NICHTSTRUKTURPROTEINE EINES NZP KSPV
IM RADIOIMMUNPRAEZIPITATIONS-ASSAY 102
5.7.3 CHARAKTERISIERUNG DER NICHTSTRUKTURPROTEINE EINES ZP KSPV-JIV
IM RADIOIMMUNPRAEZIPITATIONS-ASSAY 103
5.8 ANALYSE DER KINETIK DER NICHTSTRUKTURPROTEIN-PROZESSIERUNG IN NZP
KSPV,
ZP KSPV-JIV UND ZP KSPV REPLIKON 105
5.9 QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER HALBWERTSZEITEN DER
NICHTSTRUKTURPROTEINE UND
VORLAEUFERMOLEKUELE IM NZP KSPV, ZP KSPV-JIV UND ZP KSPV REPLIKON 110
6. DISKUSSION 114
6.1 EXPRESSION DER KSPV NICHTSTRUKTURPROTEINE UND HERSTELLUNG
MONOKLONALER ANTIKOERPER 114
6.2 IDENTIFIZIERUNG DER REIFEN NICHTSTRUKTURPROTEINE UND IHRER
VORLAEUFERMOLEKUELE
IN KSPV INFIZIERTEN ZELLEN 115
6.3 KINETIK DER NICHTSTRUKTURPROTEIN-PROZESSIERUNG IN KSPV INFIZIERTEN
ZELLEN 116
6.4 VERGLEICH DER NICHTSTRUKTURPROTEIN-PROZESSIERUNG ZWISCHEN KSPV UND
BVDV 120
6.5 VERGLEICH DER NICHTSTRUKTURPROTEIN-PROZESSIERUNG ZWISCHEN KSPV UND
HCV 121
6.6 MODELL DER REGULATION NICHT-ZYTOPATHOGENER KSPV 122
7. ZUSAMMENFASSUNG 125
8. SUMMARY 126
9. LITERATURVERZEICHNIS 127
DANKSAGUNG 142
IV
|
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spelling | Lamp, Benjamin Jakob Joachim 1978- Verfasser (DE-588)140120297 aut Charakterisierung der Nichtstrukturproteine des Virus der klassischen Schweinepest eingereicht von Benjamin Jakob Joachim Lamp 1. Aufl. Gießen VVB Laufersweiler 2011 IX, 142 S. Ill., graph. Darst. 21 cm, 350 g txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Edition scientifique Zugl.: Gießen, Univ., Diss., 2011 Classical swine fever virus cabt proteins cabt proteomics cabt Flaviviridae cabt antibody testing cabt radioimmunoassay cabt pigs cabt Pathogenität (DE-588)4205990-2 gnd rswk-swf Schweinepest-Virus (DE-588)4445053-9 gnd rswk-swf Proteinbiosynthese (DE-588)4175987-4 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Schweinepest-Virus (DE-588)4445053-9 s Pathogenität (DE-588)4205990-2 s Proteinbiosynthese (DE-588)4175987-4 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=024749341&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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