Einfluss von a8-Integrin auf das Zytoskelett und auf zellbiologische Aktivitäten in mesenchymalen Zellen:
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2011
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INHALTSVERZEICHNIS
................................................................................................
I
ZUSAMMENFASSUNG
............................................................................................
VI
SUMMARY
..........................................................................................................
VII
1
EINLEITUNG
..........................................................................................................
1
1.1
AUFBAU
UND
F
UNKTION
DER
NIERE
..................................................................................
1
1.2
PATHOLOGISCHE
VERAENDERUNGEN
IM
GLOMERULUS
...........................................................
2
1.3
AUFBAU
UND
FUNKTION
ARTERIELLER
GEFAESSE
.....................................................................
3
1.4
PATHOLOGISCHE
VERAENDERUNGEN
DER
GEFAESSWAND
...........................................................
4
1.5
MESENCHYMALE
ZELLEN
IN
NIERE
UND
GEFAESSEN
.............................................................
5
1.5.1
MESANGIUMZELLEN
(MZ)
...........................................................................................
5
1.5.2
VASKULAERE
GLATTE
MUSKELZELLEN
(VSMZ)...................................................................
6
1.6
INTEGRINE
UND
IHRE
FUNKTIONEN
....................................................................................
6
1.6.1
STRUKTUR
UND
AUFBAU
DER
INTEGRINE
..........................................................................
7
1.6.2
LIGANDENBINDUNG
UND
AKTIVIERUNG
DER
INTEGRINE
....................................................
8
1.6.3
INTEGRINE
UND
FOKALE
KONTAKTE
...............................................................................
10
1.6.4
INTEGRINE
UND
DAS
ZYTOSKELETT
..............................................................................
11
1.6.5
INTEGRINE
UND
MATRIX-METALLOPROTEINASEN
(MMP)
...............................................
13
1.6.6
INTEGRINE
UND
CONNECTIVE
TISSUE
GROWTH
FACTOR
(CTGF)
.......................................
13
1.7
INTEGRINE
DER
MESENCHYMALEN
ZELLEN
.......................................................................
14
1.8
A8SSL-INTEGRIN
...........................................................................................................
15
1.9
ZIELSETZUNG
...............................................................................................................
18
2
ERGEBNISSE
.......................................................................................................
19
2.1
ISOLATION
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
MAUS-MESANGIUMZELLEN
(MMZ)
...................
19
2.1.1
GENERIERUNG
DER
PRIMAERKULTUREN
..........................................................................
19
2.1.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
ZELLEN
................................................................................
20
2.2
ETABLIERUNG
EINES
SIRNA-VERMITTELTEN
TRANSIENTEN
YYKNOCKDOWN
VON
A8-INTEGRIN
IN
RATTEN-MESANGIUMZELLEN
(RMZ)
..........................................................................
22
2.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
ISOLIERTEN
VASKULAEREN
GLATTEN
MUSKELZELLEN
(VSMZ)
AUS
AORTEN
VON
WT
UND
................................................................................................
23
2.4
EINFLUSS
VON
A8-INTEGRIN
AUF
DAS
ZYTOSKELETT
...........................................................
25
2.4.1
VERGLEICHENDE
DARSTELLUNG
DER
F-AKTINE
..............................................................
25
2.4.2
VERGLEICHENDE
IMMUNZYTOCHEMISCHE
DARSTELLUNG
DER
STRESSFASERN
....................
27
2.4.3
NACHWEIS
DER
A-SMA
EXPRESSION
IN
MESENCHYMALEN
ZELLEN
................................
29
2.5
EINFLUSS
VON
A8-INTEGRIN
AUF
DIE
BILDUNG
FOKALER
KONTAKTE
.....................................
30
2.6
VERGLEICH
MESENCHYMALER
UND
EPITHELIALER
MARKER
..................................................
33
2.6.1
EXPRESSION
MESENCHYMALER
UND
EPITHELIALER
NLARKER
...........................................
33
2.6.2
IMMUNZYTOCHEMISCHE
DESMIN-FAERBUNG
VON
SIRNA
TRANSFIZIERTEN
RMZ
............
34
2.7
ZELLBIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FUNKTION
VON
A8-INTEGRIN
..............................
35
2.7.1
EINFLUSS
VON
A.8-INTEGRIN
AUF
ADHAESION
UND
AUSBREITUNG.
.....................................
35
2.7.2
EINFLUSS
VON
A8-INTEGRIN
AUF
MIGRATION
................................................................
36
2.7.2.1
MIGRATION
IM
WUNDHEILUNGSTEST
(SCRATCH
ASSAY)
..........................................
37
2.7.2.2
MIGRATION
IM
BARRIERE-ASSAY.
........................................................................
38
2.7.2.3 MIGRATION
IN
DER
BOYDENKAMMER
(BOYDEN
CHAMBER
ASSAY)
.........................
39
2.7.3
EINFLUSS
VON
A8-INTEGRIN
AUF
DAS
ZELLUEBERLEBEN
....................................................
40
2.7.3.1
APOPTOSE
IM
CASPASE-3
ASSAY
.......................................................................
41
2.7.3.2
HOECHST-APOPTOSEASSAY
.................................................................................
42
2.7.4
EINFLUSS
VON
A8-INTEGRIN
AUF
DAS
WACHSTUMSVERHALTEN
VON
ZELLEN
......................
44
2.8
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
INTERAKTION
VON
A8-INTEGRIN
MIT
SEINEM
POTENTIELLEN
LIGANDEN
FIBRILLIN
.....................................................................................................
46
2.8.1
ADHAESIONS
UND
AUSBREITUNGSASSAYS
.....................................................................
46
2.8.2
ADHAESIONSASSAY
MIT
CRGD-PEPTIDEN
....................................................................
48
2.9
EXPRESSION
POTENTIELL
KOMPENSATORISCHER
INTEGRINE
..................................................
50
2.9.1
BESTIMMUNG
DER
RNA-EXPRESSION
POTENTIELL
KOMPENSATORISCHER
INTEGRINE
.......
50
II
2.9.2
UNTERSUCHUNG
ZUR
FUNKTION
VON
A2
UND
A6-INTEGRIN
BEIM
ZELLUEBERLEBEN
.........
51
2.10 EINFLUSS
VON
A8-INTEGRIN
AUF
DIE
MATRIX-METALLOPROTEINASEN
(MMP)
......................
53
2.11
CTGF
EXPRESSION
IN
MESENCHYMALEN
ZELLEN
...........................................................
54
2.12
UNTERSUCHUNGEN
DES
RHOA/RHO-KINASE
(ROCK)-SIGNALWEGS
................................
55
3
DISKUSSION
.......................................................................................................58
3.1
EINFLUSS
VON
A8-INTEGRIN
AUF
ZELLMORPHOLOGIE,
ZYTOSKELETT
UND
FOKALE
KONTAKTE
....
58
3.2
DIE
BEDEUTUNG
VON
A8-INTEGRIN
FUER
ZELLBIOLOGISCHE
AKTIVITAETEN
..............................
60
3.2.1
EINFLUSS
VON
A8-INTEGRIN
AUF
ADHAESION
UND
AUSBREITUNG
......................................
60
3.2.2
EINFLUSS
VON
A8-INTEGRIN
AUF
ZELLUEBERLEBEN,
PROLIFERATION
UND
MIGRATION
.........
61
3.3
MOEGLICHE
KOMPENSATORISCHE
MECHANISMEN
.............................................................
63
3.3.1
A2
UND
A6-INTEGRIN
...............................................................................................
63
3.3.2
FUNKTION
VON
A2
UND
A6-INTEGRIN
BEIM
ZELLUEBERLEBEN
IN
A8^
/
-MMZ
..................
65
3.4
A8SSL-INTEGRIN
UND
MESENCHYMALE
MARKER
................................................................
66
3.4.1
VERMEHRTE
BILDUNG
VON
VIMENTIN
IN
AB
7
MMZ
...................................................
67
3.5
EINFLUSS
VON
A8-INTEGRIN
AUF
MATRIX-METALLOPROTEINASEN
(MMP)
...........................
68
3.6
WELCHE
ROLLE
SPIELT
DER
RHO/ROCK-SIGNALWEG?
....................................................
69
3.7
DIE
INTERAKTION
VON
FIBRILLIN
1
UND
A8SSL-INTEGRIN
...................................................
71
4
MATERIAL
UND
METHODEN
................................................................................
72
4.1
MATERIAL
.....................................................................................................................
72
4.1.1
CHEMIKALIEN
..........................................................................................................
72
4.1.2
KITS
........................................................................................................................
74
4.1.3
VERBRAUCHSMATERIALIEN
.........................................................................................
75
4.1.4 GERAETE
UND
ZUBEHOER
..............................................................................................
75
4.1.5
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.............................................................................................
77
4.1.5.1
ZELLKULTIVIERUNG.
.............................................................................................
77
4.1.5.2
KULTIVIERUNG
VON
MZ
AUS
DEN
GLOMERULI
...........................................................
78
4.1.5.3
VSMZ-ISOLATION
AUS
DER
MAUSAORTA
..................................................................
78
III
4.1.5.4
PROTEINISOLIERUNG
UND
-OUFTRENNUNG.
.................................................................
79
4.1.5.5
IMMUNZYTOCHEMISCHE
FLUORESZENZFAERBUNG
........................................................
81
4.1.5.6
ADHAESIONS
UND
AUSBREITUNGSASSAY
...................................................................
82
4.1.5.
7
MIGRATION
IN
DER
BOYDENKAMMER
.......................................................................
82
4.1.5.8
PROLIFERATIONSASSAY
............................................................................................
82
4.1.5.9
CASPASE-3-AKTIVITAET-ASSAY
.................................................................................
82
4.2
METHODEN
..................................................................................................................
84
4.2.1
ZELLKULTUR
...............................................................................................................
84
4.2.1.1
EINFRIEREN
VON
ZELLEN
.....................................................................................
84
4.2.1.2
AUFTAUEN
DER
ZELLEN
.......................................................................................
84
4.2.1.3
ZELLISOLATION
VON
RATTEN-MESANGIUMZELLEN
(RMZ)
........................................
85
4.2.1.4
ZELLISOLATION
VON
MAUS-MESANGIUMZELLEN
(MMZ)
........................................
85
4.2.1.5
ZELLISOLATION
VON
MAUS-VASKULAEREN
GLATTEN
MUSKELZELLEN
(VSMZ)
................
86
4.2.2
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.........................................................................................
86
4.2.3
PROTEINANALYSE
......................................................................................................
86
4.2.3.1
PROTEINISOLATION
.............................................................................................
86
4.2.3.2
PROTEIN-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
..............................................................
87
4.2.3.3
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE
)
.................................
87
4.2.3.4
IMMUNOBLOT-VERFAHREN
..................................................................................
88
4.2.4
IMMUNZYTOCHEMISCHE
FAERBUNGEN
.........................................................................
90
4.2.4.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
MESANGIUMZELLEN
......................................................
90
4.2.4.2
HAEMATOXYLINFAERBUNG
......................................................................................
91
4.2.4.3
FLUORESZENZFAERBUNGEN
...................................................................................
92
4.2.5
ZELLBIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
..........................................................................
93
4.2.5.1
ADHAESIONS
UND
AUSBREITUNGSASSAY
...............................................................
94
4.2.5.2
MIGRATION
.......................................................................................................
94
4.2.5.3
APOPTOSEMESSUNGEN
.......................................................................................
96
IV
4.2.5.4
PROLIFERATIONSASSAY
........................................................................................
99
4.2.5
RNA-METHODEN
.....................................................................................................
100
4.2.5.1
GRUNDLAGEN
DES
REAL-TIME-RT-PCR-VERFAHRENS
........................................
100
4.2.5.2
RNA-EXTRAKTION
...........................................................................................
100
4.2.5.3
REVERSE
TRANSKRIPTION..................................................................................
101
4.2.5.4
TAQMAN
REAL-TIME-RT-PCR
.......................................................................
102
4.2.6
SIRNA
SILENCING
..................................................................................................
103
4.2.7
.6
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
VON
RMZ
...............................................
104
4.2.7
STATISTISCHE
AUSWERTUNG
......................................................................................
105
5
LITERATURVERZEICHNIS
.....................................................................................
106
6
.
.......................................................................................................................
121
7
TABELLENVERZEICHNIS
.....................................................................................
123
8
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
...............................................................................
124
9
ANHANG
..........................................................................................................
129
PUBLIKATIONEN
.................................................................................................
VIII
DANKSAGUNG
.........................................................................................................
X
V
|
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