Funktionelle Charakterisierung des Hypoxie-induzierbaren Proteins 2:
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2011
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
...............................................................................................................................
1
1.1
DIE
BEDEUTUNG
VON
SAUERSTOFF
FUER
DEN
STOFFWECHSEL
........................................................................
1
1.2
DIE
HYPOXIE-INDUZIERBAREN
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
.......................................................................
2
1.3
MECHANISMEN
DER
SAUERSTOFFABHAENGIGEN
REGULATION
DER
HIF-A
UNTEREINHEIT
...........................
3
1.4
MECHANISMEN
DER
SAUERSTOFFUNABHAENGIGEN
REGULATION
VON
HIF
.................................................
6
1.5
ZIELGENE
VON
HIF-1
UND
HIF-2
........................................................................................................
6
1.6
HIF
IN
DER
TUMORBIOLOGIE
................................................................................................................
8
1.7
DER
WNT-SIGNALWEG
.........................................................................................................................
10
1.8
DAS
HYPOXIE-INDUZIERBARE
GEN
2
(HIG2)
.....................................................................................
12
1.9
ZIEL
DER
ARBEIT
..................................................................................................................................
15
2
MATERIAL
UND
METHODEN
......................................................................................................
16
2.1
ZELLKULTUR
..........................................................................................................................................
16
2.1.1
KULTURBEDINGUNGEN
....................................................................................................................
17
2.1.2
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
.......................................................................................
17
2.1.3
STIMULATION
VON
ZELLEN
..............................................................................................................
18
2.1.4
STIMULATION
VON
ZELLEN
MIT
OELSAEURE
.........................................................................................
18
2.2
MRNA-ANALYSE
................................................................................................................................
18
2.2.1
RNA-EXTRAKTION
.........................................................................................................................
18
2.2.1.1
RNA-EXTRAKTION
AUS
ZELLKULTUR
.......................................................................................
19
2.2.1.2
RNA-EXTRAKTION
AUS
GEWEBEPROBEN
..............................................................................
19
2.2.2
RNASE
PROTECTION
ASSAY
..........................................................................................................
20
2.2.2.1
KLONIERUNG
VON
HIG2-RPA-SONDEN
UND
-EXPRESSIONSVEKTOREN
................................20
2.2.2.2
RNASE
PROTECTION
ASSAY
..................................................................................................
27
2.2.3
REALTIME
PCR
..........................................................................................................................
28
2.3
PROTEIN-ANALYSE
................................................................................................................................
29
2.3.1
EXTRAKTION
VON
PROTEINEN
AUS
ZELLKULTUREN
............................................................................
29
2.3.2
SDS
POLYACRYLAMID
GEL
ELEKROPHORESE
(SDS-PAGE)
.........................................................
30
2.3.3
DETEKTION
DER
PROTEINE
............................................................................................................
31
2.4
IMMUNZYTOCHEMIE
.............................................................................................................................
32
2.5
IMMUNHISTOCHEMIE
............................................................................................................................
33
2.6
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
...............................................................................................................
36
2.6.1
TRANSFEKTION
..............................................................................................................................
36
2.6.1.1
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
VON
ZELLEN
MIT
SIRNAS
..........................................................36
2.6.1.2
GENERIERUNG
VON
KLONEN
MIT
INDUZIERBARER
HIG2
BZW.
HIF-1
A-UEBEREXPRESSION...
37
2.6.1.3
SELEKTION
STABIL
TRANSFIZIERTER,
POSITIVER
KLONE
..............................................................
38
2.6.2
LUCIFERASE-REPORTERGEN
ASSAY
................................................................................................
39
2.6.2.1
MESSUNG
DER
LUCIFERASE-AKTIVITAET
..................................................................................
40
2.6.2.2
MESSUNG
DER
SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET
........................................................................
40
2.6.3
MESSUNG
DER
CASPASE
3/7-AKTIVITAET
........................................................................................
41
2.6.4
BRDU-PROLIFERATIONS
ASSAY
......................................................................................................
41
2.6.5
MTS-PROLIFERATIONS
ASSAY
......................................................................................................
42
2.6.6
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
...............................................................................................................42
2.6.7
IMMUNPRAEZIPITATION
(IP)
.........................................................................................................
43
2.6.8
CHROMATIN-IMMUNPRAEZIPITATION
(CHIP)
..................................................................................
44
2.6.9
ANGIOGENESE
ASSAY
(MATRIGEL
TUBE
FORMATION
ASSAY)
........................................................
47
2.7
TIEREXPERIMENTELLE
ARBEITEN
............................................................................................................
47
2.7.1
TIERHALTUNG
................................................................................................................................47
2.7.2
SUBKUTANE
INJEKTION
VON
TUMORZELLEN
....................................................................................48
2.7.3
TOETUNG
UND
PROBENENTNAHME
...................................................................................................
48
2.8
STATISTISCHE
AUSWERTUNG
...................................................................................................................
48
3
ERGEBNISSE
..........................................................................................................................
49
3.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
HYPOXISCHEN
REGULATION
VON
HIG2
.............................................................
49
3.1.1
HIG2
WIRD
AUCH
AUF
PROTEINEBENE
DURCH
HYPOXIE
INDUZIERT
................................................
50
3.1.2
DIE
CHROMATIN-IMMUNPRAEZIPITATION
ZEIGT
DIE
BINDUNG
VON
HIF-1
AN
DEN
HIG2
PROMOTOR
IN
LEBENDEN
ZELLEN
...................................................................................................
51
3.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FUNKTION
VON
HIG2
.......................................................................................
53
3.2.1
VORBEREITENDE
ARBEITEN
FUER
DIE
FUNKTIONELLEN
ANALYSEN
VON
HIG2
....................................
53
3.2.1.1
GENERIERUNG
VON
HELA-KLONEN
MIT
DOXYCYCLIN-INDUZIERBARER
HIG2
UEBEREXPRESSION
.................................................................................................................
53
3.2.1.2
ETABLIERUNG
EINES
SIRNA-VERMITTELTEN
HIG2-YYKNOCK-DOWNS
....................................
55
3.2.2
ZELLBIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FUNKTION
VON
HIG2
...................................................
58
3.2.2.1
UNTERSUCHUNG
DER
WIRKUNG
VON
HIG2
AUF
DIE
PROLIFERATION
........................................
58
3.2.2.2
UNTERSUCHUNG
DER
WIRKUNG
VON
HIG2
AUF
DIE
APOPTOSE
.............................................
59
3.2.2.3
UNTERSUCHUNG
DER
AKTIVIERUNG
DES
KANONISCHEN
WNT-SIGNALTRANSDUKTIONSWEGES
DURCH
HIG2
......................................................................................................................
60
3.2.3
EFFEKTE
DER
HIG2-UEBEREXPRESSION
AUF
DAS
TUMORWACHSTUM
IM
XENOGRAFT-MODELL
.......
63
3.2.3.1
DARSTELLUNG
DER
VASKULARISIERUNG
HIG2-POSITIVER
UND
HIG2-NEGATIVER
TUMORE
IM
XENOGRAFT-MODELL
......................................................................................................
67
3.2.3.2
NACHWEIS
UND
QUANTIFIZIERUNG
DER
MAKROPHAGENINFILTRATION
IN
DEN
XENOGRAFTS
.....68
3.2.4
DARSTELLUNG
DER
SUBZELLULAEREN
LOKALISATION
VON
HIG2
IN
ZELLKULTURZELLEN
.........................
70
3.2.5
HIG2
IST
EIN
LIPIDTROPFEN-PROTEIN
...........................................................................................
74
3.2.6
KINETIK
DER
INDUKTION
UND
DES
ABBAUS
DES
HIG2-PROTEINS
...................................................
78
3.2.7
WIRKUNG
VON
HIG2
AUF
DIE
INTRAZELLULAERE
LIPIDAKKUMULATION
.............................................
80
3.2.8
NACHWEIS
VON
HIG2
BEI
PATHOLOGISCHER
LIPIDAKKUMULATION
IN
VIVO
..................................
82
3.2.8.1
NACHWEIS
VON
HIG2
IN
ATHEROSKLEROTISCHEN
KORONARARTERIEN
.......................................
83
3.2.8.2
NACHWEIS
VON
HIG2
IN
DER
NICHT-ALKOHOLISCHEN
HEPATOSTEATOSE
..................................
85
3.2.8.3
NACHWEIS
VON
HIG2
IM
NIERENZELLKARZINOM
.................................................................
86
3.2.9
DARSTELLUNG
DER
EFFEKTE
DER
HIG2-UEBEREXPRESSION
AUF
DIE
ZYTOKIN-UND
CHEMOKIN
EXPRESSION
IN
HELA-ZELLEN
.......................................................................................................
89
3.2.10
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FUNKTION
VON
HIG2
IN
ENDOTHELIALEN
SKHEP1
-ZELLEN
......................
91
3.2.10.1
GENERIERUNG
VON
SKHEP1
-ENDOTHELZELLEN
MIT
DOXYCYCLIN-INDUZIERBARER
HIG2-ODER
HIF-1
A-HA-UEBEREXPRESSION
.....................................................................
91
3.2.10.2
DARSTELLUNG
DER
EFFEKTE
DER
HIG2-UEBEREXPRESSION
AUF
DIE
ZYTOKIN
UND
CHEMOKINEXPRESSION
IN
SKHEP1-ZELLEN
.....................................................................
93
3.2.10.3
DARSTELLUNG
DER
ANGIOGENEN
AKTIVITAET
DER
HIG2-UEBEREXPRESSION
IN
VITRO
(MATRIGEL
TUBE
FORMATION
ASSAY)
..................................................................................
94
4
DISKUSSION
...........................................................................................................................
96
4.1
HIG2
IM
KLARZELLIGEN
NIERENZELLKARZINOM:
PATHOGENETISCHER
FAKTOR
ODER
EPIPHAENOMEN?
.....
97
4.2
MECHANISMEN
DER
HYPOXISCHEN
LIPIDAKKUMULATION
......................................................................
99
4.3
INTRAZYTOPLASMATISCHE
LIPIDTROPFEN
(LIPID
DROPLETS)
ALS
DYNAMISCHE
ZELLORGANELLEN
..............
101
4.4
DIE
FUNKTION
VON
HIG2
ALS
LIPIDTROPFEN-PROTEIN
.......................................................................
104
4.5
DIE
PATHOPHYSIOLOGISCHE
ROLLE
VON
HIG2
....................................................................................
106
5
ZUSAMMENFASSUNG..........................................................................................................
110
6
SUMMARY
...........................................................................................................................
111
7
LITERATURVERZEICHNIS
.........................................................................................................
112
8
ANHANG
.........
.....................................................................................................................
127
PUBLIKATION
DANKSAGUNG
|
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| spelling | Gimm, Tina Verfasser (DE-588)1018316434 aut Funktionelle Charakterisierung des Hypoxie-induzierbaren Proteins 2 vorgelegt von Tina Gimm 2011 128 S. Ill., graph. Darst. 21 cm txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Erlangen-Nürnberg, Univ., Diss., 2011 (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:bvb:29-opus-29248 https://open.fau.de/handle/openfau/1977 Verlag kostenfrei Volltext https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:29-opus-29248 Resolvingsystem DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=024657291&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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