Molekulare Grundlagen der ramRA-vermittelten Regulation der multidrug-resistance-Effluxpumpe AcrAB-TolC bei Salmonella und Citrobacter freundii:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Aachen
Shaker
2011
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| Schriftenreihe: | Berichte aus der Pharmazie
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I
INHALT
1 EINLEITUNG.. 1
1.1 MECHANISMEN DER MULTIDRUG RESISTANCE BEI ENTEROBACTERIACEAE 1
1.2 DIE FAMILIE DER ENTEROBACTERIACEAE 3
1.2.1 DIE GATTUNG SALMONELLA 4
1.2.2 DIE GATTUNG CITROBACTER 5
1.2.3 ANTIBIOTIKATHERAPIE UND RESISTENZLAGE 7
1.3 EFFLUXPUMPEN 10
1.4 MDR-EFFLUXPUMPE ACRAB-TOLC 11
1.5 LOKALE UND GLOBALE REGULATION DER ACRAB-TOLC-EFFLUXPUMPE 16
1.5.1 DIE TETR-FAMILIE 18
1.5.2 DIE ARAC-XYLS-FAMILIE 21
1.5.3 DIE TRANSKRIPTIONSREGULATOREN MARA/MARR, SOXR/SOXS UND ROB 21
1.5.4 DAS RA/»UE4-OPERON 24
1.6 ZIEL DER ARBEIT 27
2 MATERIAL UND METHODEN 29
2.1 MATERIAL 29
2.1.1 BAKTERIENSTAEMME 29
2.1.2 PLASMIDE 31
2.1.3 OLIGONUKLEOTDDE 32
2.1.4 NAEHRMEDIEN 34
2.1.5 PUFFERUND LOESUNGEN 34
2.1.6 ANTIBIOTIKA 35
2.1.7 ENZYME 35
2.1.8 MOLEKULARGEWICHTS- UND MENGENSTANDARDS 36
2.1.9 CHEMIKALIEN 36
2.1.10 FERTIGKITS 38
2.1.11 GERAETE 3
2.1.12 VERBRAUCHSMATERIALIEN 40
2.1.13 SOFTWARE 40
2.2 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 4!
2.2.1 ANLEGEN UND VERWENDEN VON DAUERKULTUREN 41
2.2.2 HERSTELLUNG VON UEBERNACHTKULTUREN 41
2.2.3 STAMMHALTUNG UND ANZUCHT -H
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/1017145423
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
IL
2.2.4 ERSTELLUNG VON WACHSTUMSKURVEN 42
2.2.5 BESTIMMUNG DER MINIMALEN HEMMKONZENTRATION 42
2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 44
2.3.1 ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA 44
2.3.1.1 ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA MITTELS KOCHMETHODE 44
2.3.1.2 ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA MITTELS CTAB-METHODE 44
2.3.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 45
2.3.2.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA MITTELS ALKALISCHER LYSE 45
2.3.2.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA MITTELS FERTIGKITS 46
2.3.3 AUFREINIGUNG UND KONZENTRIERUNG VON DNA 48
2.3.3.1 ETHANOLPRAEZIPITATION 48
2.3.3.2 PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION 48
2.3.3.3 AUFREINIGUNG VON NUKLEINSAEURELOESUNGEN MITTELS SILIKAT-SAEULEN 49
2.3.3.4 ISOLIERUNG UND AUFREINIGUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN 49
2.3.3.5 ENZYMATISCHE AUFREINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN 50
2.3.4 KONZENTRARIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEURELOESUNGEN 50
2.3.4.1 PHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG MITTELS NANODROP 50
2.3.4.2 KONZENTRATIONSABSCHAETZUNG IM AGAROSEGEL 51
2.3.5 AUFTRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN MITTELS AGAROSEGELELEKTROPHORESE 51
2.3.6 AMPLIFIKATION VON DNA-FRAGMENTEN 52
2.3.6.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 52
2.3.6.2 GEZIELTE FUSION REKOMBINANTER DNA-MOLEKUELE MITTELS SOEING-PCR 54
2.3. 7 ENZYMATISCHE DNA-MODIFIKATIONEN 57
2.3.~.L RESTRIKDONSVERDAU 57
2.3. 7.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON 5 -DN A-ENDEN 57
2.3.^.3 LIGATION 58
2.3.8 HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN UND TRANSFORMATION 59
2.3.8.1 KOMPETENTE ZELLEN NACH CAC12-METHODE ZUR LAGERUNG BEI -80C 59
2.3.8.2 TRANSFORMATION CHEMISCH KOMPETENTER ZELLEN 59
2.3.8.3 HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN FUER DIE ELEKTROPORATION 60
2.3.8.4 ELEKTROPORATION 60
2.3.9 SOUTHERN BLOT UND HYBRIDISIERUNG MITTELS RAMR-DNA-SONDE 61
2.3.10 DNA-SEQUENZIERUNG 63
2.3.10.1 SEQUENZIERUNG VON PCR-PRODUKTEN UND PLASMIDEN 63
IMAGE 3
INHALT HI
2.3.10.2 DIREKTSEQUENZIERUNG CHROMOSOMALER DNA 65
2.3.11 GENDISRUPTION NACH DATSENKO UND WANNER 66
2.3.12 ISOLIERUNG DER GESAMT-RNA 69
2.3.13 UEBERPRUEFUNG DER RNA-QUALITAET 70
2.3.14 HERSTELLUNG VON CDNA MITTELS REVERSER TRANSKRIPTION 71
2.3.15 QUANTITATIVE REAL-TIRNE-PCR 72
2.3.16 REPORTERGEN-ASSAY ZUR UNTERSUCHUNG EINER MOEGLICHEN
RAMR-BINDUNGSSTELLE 73
2.3.17 KOMPLEMENTATIONSVERSUCHE MIT PLASMIDKODIERTEM RAMK. 74
3 ERGEBNISSE 75
3.1 SALMONELLA 75
3.1.1 EINFUEHRUNG 75
3.1.2 SEQUENZIERUNG DES /»/»R/^L-INTERGENISCHEN BEREICHS SOWIE DES
RAMK-GENS 76
3.1.3 KONSTRUKTION VON REPORTERGEN-PLASMIDEN ZUR CHARAKTERISIERUNG EINER
RAMR-BINDUNGSSTELLE 77
3.1.4 CHARAKTERISIERUNG EINER MOEGLICHEN RAMR-BINDUNGSSTELLE MITTELS
EINES
REPORTERGEN-ASSAYS 80
3.1.5 HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON RCAWR-KNOCKOUT-MUTANTEN 82
3.1.6 IDENTIFIZIERUNG VON RAMR-BINDUNGSSTELLEN IN GENOMDATENBANKEN
MITTELS
BLAST-SUCHE 84
3.2 GTROBACTER 85
3.2.1 EINFUEHRUNG. 85
3.2.2 SCREENING VERSCHIEDENER ENTEROBACTERIACEAE HINSICHTLICH DER GENE
RAMK UND RAMA 86
3.2.3 SEQUENZIERUNG DES RA/»R/L-BEREICHS UND BESTIMMUNG VON
SEQUENZHOMOLOGIEN 87
3.2.4 HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINER RAWR-DELETIONSMUTANTE VON
CITMBAETERFMINDUEVX) 89
3.2.4.1 BESTIMMUNG DER EMPFINDLICHKEIT GEGENUEBER VERSCHIEDENEN
ANTIBIOTIKA IN
AN- UND ABWESENHEIT EINES EFFLUXPUMPENINHIBITORS 91
3.2.4.2 KONSTRUKTION VON RA*R-KOMPLEMENTATIONSPLASMIDEN 92
3.2.4.3 EINFLUSS EINER KOMPLEMENTATION MIT PLASMIDKODIERTEM RAMK AUF DIE
EFFIUXAKTIVITAET....94
3.2.4.4 EXPRESSIONSANALYSE DER GENE RAMA UND ACRB 95
3.2.5 CHARAKTERISIERUNG DER KLINISCHEN ISOLATE VON GTROBACTERFNUNDUE. T
3.2.5.1 BESTIMMUNG DER EMPFINDLICHKEIT GEGENUEBER VERSCHIEDENEN
ANTIBIOTIKA IN
AN- UND ABWESENHEIT EINES EFFLUXPUMPENINHIBITORS 99
IMAGE 4
RV
3.2.5.2 NACHWEIS VON RARR-GENSEQUENZEN DURCH HYBRIDISIERUNG MIT EINER
N»WR-SONDE 100 3.2.5.3 SEQUENZIERUNG VON RAMK IN KLINISCHEN ISOLATEN VON
CFREUNDII. 101
3.2.5.4 SEQUENZIERUNG DER INSERTION STROMAUFWAERTS VON RAMA IM KLINISCHEN
ISOLAT
C. FMMDUE 1394. 102
3.2.5.5 KOMPLEMENTATIONSVERSUCHE MIT PLASMIDKODIERTEM RAMK. 102
3.2.5.6 EXPRESSIONSANALYSE MITTELS QUANTITATIVER REAL-TIME-PCR 103
4 DISKUSSION 107
4.1 VERBREITUNG DER GENE RAMK-RAMA FUER DAS REGULATORPAAR RAMR/RAMA
BEI ENTEROBACTERIACEAE 107
4.2 CHARAKTERISIERUNG VON RAMKA IN GTROBACTER JREUNDUE. 109
4.2.1 CHARAKTERISIERUNG VON RAMKA IN BEZUG AUF SEQUENZHOMOLOGIEN 109
4.2.2 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG VON RAMKA IN CFREUNDII. 110
4.3 IDENTIFIZIERUNG DER MOLEKULAREN URSACHEN DES MDR-EFFLUX-PHAENOTYPS
BEI
IN VITRO SELEKTIERTEN MUTANTEN VON S. TYPHIMURIUM UND S. HADAR. 113
4.4 MOLEKULARE ANALYSE EINER POTENTIELLEN RAMR-BINDUNGSSTELLE 114
4.5 VERGLEICHENDE QUANTITATIVE ANALYSE DES EFFEKTS VON RAWR-DELETION UND
VARIATIONEN
DER RAMR-BINDUNGSSTELLE 116
4.6 BEDEUTUNG VON RAMKA IN KLINISCHEN ISOLATEN VON CITROBACTERFREUNDUE.
118
4.7 AUSBLICK 121
5 ZUSAMMENFASSUNG 125
6 LITERATUR. 129
7 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 145
8 ANHANG 151
8.1 GEFAHRSTOFFVERZEICHNIS 151
DANKSAGUNG. 155
LEBENSLAUF: 157
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