Untersuchungen zur konformationellen Regulation von Ligandenbindungsstellen des Zytoskelettproteins Talin:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Aachen
Shaker
2011
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| Schriftenreihe: | Berichte aus der Biologie
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 ZELL-MATRIX-VERBINDUNGEN 1
1.2 ZELLMIGRATION UND DYNAMIK VON FOKALEN ADHAESIONEN 2
1.3 DIE PROTEINE: INTEGRIN, VINCULIN UND TALIN 4
1.3.1 INTEGRIN 4
1.3.2 VINCULIN 6
1.3.3 TALIN 9
1.4 ZIELSTELLUNG DIESER ARBEIT 15
2 MATERIAL UND METHODEN 17
2.1 VERWENDETE MATERIALIEN 17
2.1.1 CHEMIKALIEN, KULTURMEDIEN, MEDIENZUSAETZE UND PUFFER 17
2.1.2 GERAETE 18
2.1.3 BAKTERIENSTAEMME UND EUKARYOTISCHE ZELLLINIEN 19
2.1.4 OLIGONUKLEOTIDE, PLASMIDE UND CDNA-EXPRESSIONSKONSTRUKTE 19
2.1.5 ANTIKOERPER 21
2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 22
2.2.1 TRANSFORMATION IN .CO//-ZELLEN 22
2.2.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 23
2.2.3 VERWENDUNG VON GLYCEROLSTOCKLOESUNGEN 24
2.2.4 DNA-RESTRIKTION UND DEPHOSPHORYLIERUNG VON PLASMIDEN 24
2.2.5 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE UND GELEXTRAKTION 24
2.2.6 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 25
2.2.7 ZIELGERICHTETE MUTAGENESE UND UNGERICHTETE INSERTION MIT HILFE
EINES
TRANSPOSASE-SYSTEMS 26
2.2.8 LIGATION 27
2.2.9 KLONIERUNG VON KURZEN OLIGONUKLEOTIDEN (LINKER) 28
2.3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 28
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/1014797470
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
2.3.1 PROTEINEXPRESSION IN E.COLI 28
2.3.2 REINIGUNG VON HIS- UND GST-MARKIERTEN PROTEINEN UEBER
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 29
2.3.3 REINIGUNG VON PROTEINEN UEBER LONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE 29
2.3.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN VON PROTEINEN (BCA-TEST) 30
2.3.5 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 30
2.3.6 WESTERN-BLOTTING UND IMMUNDETEKTION 31
2.3.7 KOIMMUNPRAEZIPITATION (PULL DOWN) 32
2.3.8 PEPTIDSCAN 32
2.3.9 ANALYSE DER DIMERBILDUNG 33
2.3.10 PROTEINFAELLUNG MIT TRICHLORESSIGSAEURE (TCA) 34
2.3.11 PROTEOLYSE-SCHUTZ-VERSUCH 34
2.3.12 RP-HPLC 35
2.3.13 MASSENSPEKTROMETRIE 35
2.4 ZELLBIOLOGIE 36
2.4.1 ZELLKULTUR 36
2.4.2 TRANSIENTS TRANSFEKTION 37
2.4.3 HERSTELLUNG VON ZELLEXTRAKTEN 38
2.4.4 IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG 39
2.5 MIKROSKOPIE 39
2.5.1 FLUORESZENZMIKROSKOPIE UND BILDBEARBEITUNG 39
2.5.2 FRET (FOERSTER RESONANZ ENERGIE TRANSFER) - THEORIE UND PRAXIS 40
2.5.3 FLUORESCENCE RECOVERY AFTER PHOTOBLEACHING (FRAP) 44
3 ERGEBNISSE 47
3.1 LOKALISATION VON TALINFRAGMENTEN IN C2C12-ZELLEN 47
3.2 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG VON TALINC 50
3.2.1 TALINC DIMERISIERT UEBER HELIX 62 AM CARBOXYTERMINUS 50
3.2.2 TALINC BINDET SS-LNTEGRIN 52
3.2.3 TALINC UND -FRAGMENTE BINDEN VINCULIN MIT UNTERSCHIEDLICHER
AFFINITAET 55
3.2.4 TALIN VBS H50 BINDUNG STABILISIERT DEN VINCULINKOPF 59
IMAGE 3
3.3 LOKALISATION VON TALINC-FRAGMENTEN UND -MUTANTEN IN C2C12-ZELLEN 62
3.4 LOKALISATION VON TALIN, TALINFRAGMENTEN UND MUTANTEN IN
VINCULIN-DEFIZIENTEN
FIBROBLASTEN 68
3.5 DYNAMIKEN VON TALIN, TALINC UND TALINC-FRAGMENTEN IN FOKALEN
ADHAESIONEN 72
3.6 GENERIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON TALINC-KONFORMATIONSSENSOREN
FUER FRET- MESSUNGEN 77
3.6.1 FLUOROPHOR-INSERTION IN TALINC MITTELS 7N5-TRANSPOSASE 78
3.6.2 SUBZELLULAERE LOKALISATION UND EXPRESSION DER TALINC-KONSTRUKTE MIT
INTERNEN
CFP-POSITIONEN 80
3.6.3 VINCULINBINDUNG DER TALINC-KONSTRUKTE MIT INTERNEN CFP-POSITIONEN
86
3.6.4 INTEGRINBINDUNG DER TALINC-KONSTRUKTE MIT INTERNEN CFP-POSITIONEN
87
3.6.5 DIMERISIERUNG DER TALINC-KONSTRUKTE MIT INTERNEN CFP-POSITIONEN 88
3.6.6 UNTERSCHEIDUNG ZWISCHEN INTER- UND INTRAMOLEKULAREM FRET DER
TALINC-FRET- SENSOREN 89
3.7 ANALYSE DER TALINC-FRET-SENSOREN IN VINCULIN KNOCK-OUT ZELLEN 99
4 DISKUSSION 101
4.1 TALINC ALS MODELL FUER DIE REGULATION VON LIGANDEN-BINDUNGSSTELLEN
101
4.2 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG VON LIGANDEN-BINDUNGSSTELLEN IN
TALINC 104
4.2.1 TALINC DIMERISIERT UEBER DIE C-TERMINALE HELIX 62 104
4.2.2 TALINC BINDET AN DIE MEMBRANPROXIMALE REGION VON SS-LNTEGRINEN 105
4.2.3 TALINC BEINHALTET EINE KRYPTISCHE, AKTIVIERBARE UND EINE
KONSTITUTIV AKTIVE
BINDUNGSSTELLE FUER VINCULIN 107
4.3 EINFLUSS DER BINDUNGSSTELLENAKTIVITAET AUF DIE SUBZELLULAERE
LOKALISATION VON TALINC 111
4.3.1 EINFLUSS DER INTEGRINBINDUNG AUF DIE LOKALISATION DER IBS2-DOMAENE
112
4.3.2 EINFLUSS DER AKTIVITAET DER ABS3 AUF DIE LOKALISATION DER
ABS3/DS-DOMAENE .113
4.3.3 EINFLUSS DER VINCULINBINDUNG AUF DIE LOKALISATION DER
TALINC-DOMAENEN 116
4.3.4 WECHSELSEITIGE ABHAENGIGKEIT DER AKTIVITAET DER TALINC-DOMAENEN IBS2
UND
ABS3/DS 116
4.4 ANALYSE VON PROTEINDYNAMIKEN VON TALIN IN FOKALEN ADHAESIONEN 118
4.4.1 EINFLUSS DER IBS2- UND ABS3/DS-DOMAENE AUF DIE AUSTAUSCH-RATE VON
TALINC IN
FOKALEN ADHAESIONEN 119
IMAGE 4
4.4.2 REGULATION DER LIGANDENBINDUNG AN DIE IBS2-DOMAENE 120
4.4.3 SEQUENTIELLE AKTIVIERUNG VON LIGANDENBINDUNGSSTELLEN IN TALINC 121
4.5 GENERIERUNG UND ETABLIERUNG VON TALINC-FRET-KONFORMATIONSSENSOREN
125
4.5.1 CHARAKTERISIERUNG DER TALINC-KONSTRUKTE MIT INTERNEM CFP 125
4.5.2 UNTERSCHEIDUNG VON INTER- UND INTRAMOLEKULAREM FRET IN
TALINC-FRET- SENSOREN 128
4.5.3 FRET IN TALINC IN ABHAENGIGKEIT VON VINCULIN 130
4.6 AUSBLICK 133
5 ZUSAMMENFASSUNG 137
LITERATURVERZEICHNIS 139
ANHANG A. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS I
ANHANG B. ABBILDUNGSVERZEICHNIS IM
ANHANG C. TABELLENVERZEICHNIS V
ANHANG D. NUKLEIN- UND AMINOSAEURESEQUENZEN DER VERWENDETEN PROTEINE VI
ANHANG E. CDNA-KONSTRUKTE XIX
ANHANG F. OLIGONUKLEOTIDE XXII
ANHANGG. VEKTORKARTEN XXVI
ANHANG H. LOKALISATION VON TALIN, TALINFRAGMENTEN UND MUTANTEN IN
VINCULIN- DEFIZIENTEN FIBROBLASTEN XXXVI
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