Systematische Untersuchungen zum NOD2-Signaltransduktionsweg mittels RNA-Interferenz:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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2010
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1.
EINLEITUNG
.............................................................................................................................
1
1.1
ANGEBORENE
UND
ERWORBENE
IMMUNITAET
..........................................................................
1
1.2
NOD-LIKE
-REZEPTOREN
(NLRS)
..............................................................................................
4
1.3
NUCLEOTIDE-BINDING
OLIGOMERIZATION
DOMAIN
CONTAINING
2
(NOD2)
.............................
6
1.3.1
MURAMYLDIPEPTID
(MDP)
............................................................................................
6
1.3.2
FUNKTION
VON
NOD2
ALS
TEIL
DES
IMMUNSYSTEMS
..................................................
8
1.3.3
NOD2-SIGNALWEG
...................................................................................................
11
1.4
NUCLEAR
FACTOR
KAPPA-LIGHT-CHAIN-ENHANCER
OF
ACTIVATED
B
CELLS
(NF
K
B)
..................
14
1.5
NF-KB-SIGNALWEG
.....................................................................................................................
15
1.6
HOCHDURCHSATZ
SCREENS
ALS
MITTEL
ZUR
ENTSCHLUESSELUNG
VON
SIGNALWEGEN
...............
17
1.7
RNA-INTERFERENZ
...............................................................................................................
18
1.8
RNA-INTERFERENZ
ALS
WERKZEUG
ZUR
ENTSCHLUESSELUNG
VON
SIGNALWEGEN
.....................
21
1.9
ZIEL
DER
ARBEIT
................................................................................................................
23
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
...................................................................................................
24
2.1
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
..........................................................................
24
2.2
ZELLBIOLOGISCHE
ARBEITEN
.................................................................................................24
2.2.1
ZELLLINIEN
UND
KULTIVIERUNG
......................................................................................
24
2.2.2
BESTIMMUNG
DER
ZELLDICHTE
.....................................................................................25
2.2.3
AUSSAAT
UND
ERNTE
...................................................................................................25
2.2.4
TRANSFEKTION
VON
ZELLEN
MIT
PLASMID-DNA
............................................................26
2.2.5
REVERSE
TRANSFEKTION
VON
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
MIT
SIRNA
...............................27
2.3
MIKROSKOPIE
....................................................................................................................
28
2.3.1
FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNGEN
IN
HELAS3-ZELLEN
........................
28
2.3.2
FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNGEN
IN
CACO-2-ZELLEN
......................
29
2.3.3
IMMUNHISTOCHEMISCHE
FAERBUNG
VON
GEWEBESCHNITTEN
........................................
29
2.4
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
....................................................................................
30
2.4.1
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
..............................................................................
.....30
2.4.2
AUFREINIGUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
............................................................
30
2.4.3
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
ZELLKULTUREN
.......................................................
30
2.4.4
QUALITAETSKONTROLLE
DER
ISOLIERTEN
RNA
....................................................................
31
2.4.5
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
...................................................
31
2.4.6
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
.......................................................................................
32
2.4.7
CDNA-SYNTHESE
......................................................................................................
32
2.4.8
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.......................................................................
33
2.4.9
REVERSE
TRANSKRIPTASE-POLYMERASE-KETTENREAKTION
(RT-PCR)
.............................
34
2.5
ERSTELLUNG
VON
FUSIONSKONSTRUKTEN
MIT
HILFE
DES
GATEWAY-SYSTEMS
...................
34
2.5.1
ERSTELLUNG
VON
GATEWAY-KOMPATIBLEN
PLASMIDEN
..........................................
34
2.5.2
KLONIERUNG
IN
EINEN
ENTRY -VEKTOR
DES
GATEWAY-SYSTEMS
............................
34
2.5.3
LR-REKOMBINATION
.................................................................................................35
2.5.4
TRANSFORMATION
VON
ONE
SHOT
TOP10
-ZELLEN
.....................................................
36
2.6
BIOCHEMISCHE
METHODEN
................................................................................................
36
2.6.1
HERSTELLUNG
VON
DENATURIERTEN
PROTEINLYSATEN
AUS
ZELLEN
....................................
36
2.6.2
ISOLIERUNG
VON
ZELLKERNEN
.......................................................................................
36
2.6.3
KOIMMUNPRAEZIPITATION
.............................................................................................
37
2.6.4
DENATURIERENDE
GELELEKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
(SDS-PAGE)
.......................
38
2.6.5
ELEKTROTRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
MEMBRANEN
( WESTERN
BLOT )
.........................
38
2.6.6
IMMUNDETEKTION
VON
PROTEINEN
..............................................................................
38
2.6.7
ELISA
.......................................................................................................................
39
2.6.8
DUALES
LUZIFERASE-REPORTERGEN-SYSTEM
...............................................................40
2.7
DIE
DRUGGABLE
GENOME
-SIRNA-BANK
...........................................................................
41
2.8
OPTIMAL
BALANCE
FACTOR
(OBF)
......................................................................................42
2.9
DURCHFUEHRUNG
DES
RNAI
SCREENS
................................................................................43
2.10
STATISTISCHE
METHODEN
ZUR
AUSWERTUNG
DES
RNAI
SCREENS
.......................................44
2.10.1
NORMALISIERUNG
DER
MESSWERTE
..............................................................................44
2.10.2
Z-FAKTOR
..................................................................................................................
44
2.10.3
Z-SCORE
..................................................................................................................
45
3.
ERGEBNISSE
.........................................................................................................................
46
3.1
ETABLIERUNG
DER
VERSUCHSKONFIGURATION
........................................................................46
3.1.1
VERGLEICH
VERSCHIEDENER
TRANSFEKTIONSMITTEL
UND
BEDINGUNGEN
.........................46
3.1.2
DETEKTION
VON
AKTIVIERTEM
NF-KB
IN
HEK-293-ZELLEN
..........................................
48
3.1.3
AUFBAU
UND
ABLAUF
DES
RNAI
SCREENS
................................................................
49
3.1.4
UEBERPRUEFUNG
DER
GEWAEHLTEN
KOMPONENTEN
UND
PARAMETER
.................................
50
3.1.5
AUFBAU
DER
96-LOCH-ZELLKULTURPLATTEN
....................................................................
51
3.2
ERGEBNISSE
DES
PRIMAEREN
RNAI
SCREENS
....................................................................
52
3.2.1
QUALITAETSKONTROLLE
DER
96-LOCH-ZELLKULTURPLATTEN
...................................................
53
3.2.2
FESTLEGUNG
VON
GRENZWERTEN
................................................................................
54
3.3
ERSTE
UND
ZWEITE
UEBERPRUEFUNG
DER
KANDIDATENGENE
....................................................
55
3.4
EINFLUSS
DER
KANDIDATENGENE
AUF
DIE
DURCH
TNF-A
INDUZIERTE
NF-KB-AKTIVIERUNG
..........................................................................................................
57
3.5
BESTAETIGUNG
DER
KANDIDATENGENE
IN
CACO-2-ZELLEN
..................................................
57
3.6
IN
SILICO-UNTERSUCHUNG
DER
KANDIDATENGENE
.................................................................
58
3.6.1
BEWERTUNG
DER
KANDIDATENLISTEN
ANHAND
DER
INTERAKTIONSDATENBANK
STRING
8.3
..............................................................................................................
58
3.6.2
INTERAKTIONSNETZWERK
DER
VERBLEIBENDEN
20
KANDIDATENGENE
.............................
60
3.7
UNABHAENGIGE
EXPERIMENTELLE
UEBERPRUEFUNG
DER
KANDIDATENGENE
...............................
61
3.7.1
TRANSKRIPTION
DER
KANDIDATENGENE
IN
VERSCHIEDENEN
HUMANEN
ZELLLINIEN
..........
61
3.7.2
EINFLUSS
AUSGEWAEHLTER
KANDIDATENGENE
AUF
DIE
VON
NOD2
ABHAENGIGE
SEKRETION
VON
IL-8
IN
HEK-293-ZELLEN
.................................................................
62
3.7.3
CALCIUM
CHANNEL,
VOLTAGE-DEPENDENT,
ALPHA
2/DELTA
SUBUNIT
1
(CACNA2D1)
.........................................................................................................
64
3.7.4
ARGININE
VASOPRESSIN
RECEPTOR
2
(AVPR2)
...........................................................
65
3.7.5
KARYOPHERIN
(IMPORTIN)
BETA
1
(KPNB1)
...............................................................66
3.7.6
FERM
AND
PDZ
DOMAIN
CONTAINING
2
(FRMPD2)
..............................................
67
3.7.6.1
FRMPD2
GEHT
KEINE
BINDUNG
MIT
I
K
B
Q
EIN
.....................................................
67
3.7.6.2
INTERAKTION
VON
FRMPD2
UND
NOD2
..............................................................
68
3.7.6.3
FRMPD2-DSRED
KOLOKALISIERT
MIT
NOD2-GFP
IN
HELAS3-ZELLEN
AN
DER
ZELLMEMBRAN
.......................................................................................................
68
3.7.6.4
FRMPD2
KOLOKALISIERT
MIT
NOD2
IN
DARMBIOPSIEN
.........................................69
3.7.6.5
INTERAKTION
VON
FRMPD2
UND
RIPK2
................................................................
70
3.7.6.6
SPEZIFITAET
VON
FRMPD2
FUER
DEN
NOD2-SIGNALWEG
.........................................
71
3.7.6.7
KERNLOKALISATION
VON
FRMPD2
NACH
INFEKTION
MIT
LISTERIA
MONOCYTOGENES
.................................................................................................
72
4.
DISKUSSION
.......................................................................................................................
74
4.1
VOR
UND
NACHTEILE
DER
VERWENDETEN
VERSUCHSKONFIGURATION
....................................
74
4.2
BEWERTUNG
DER
ERGEBNISSE
DES
RNAI
SCREENS
..........................................................
76
4.3
IN
SILICO-ANALYSE
DER
KANDIDATENGENLISTEN
....................................................................
80
4.4
EXPERIMENTELLE
UEBERPRUEFUNG
UND
EINORDNUNG
DER
KANDIDATENGENE
IN
DEN
NOD2-SIGNALWEG
...........................................................................................................
81
4.4.1
BEDEUTUNG
DES
PROTEASOMS
FUER
DEN
NOD2-SIGNALWEG
.......................................
83
4.4.2
CACNA2D1
.............................................................................................................
84
4.4.3
AVPR2
....................................................................................................................
85
4.4.4
KPNB1
....................................................................................................................
85
4.4.5
FRMPD2
ALS
TEIL
EINES
MEMBRANSTAENDIGEN
SIGNALKOMPLEXES
...........................
87
4.4.6
MOEGLICHE
FUNKTION
VON
FRMPD2
IM
ZELLKERN
.......................................................
88
4.5
AUSBLICK
..........................................................................................................................
90
5.
ZUSAMMENFASSUNG
..........................................................................................................
91
6.
ABSTRACT
..............................................................................................................................92
7.
LITERATUR
..............................................................................................................................
93
8.
ANHANG
..............................................................................................................................
111
8.1
PUFFER
UND
LOESUNGEN
....................................................................................................
111
8.2
VERWENDETE
CHEMIKALIEN,
ZUSAETZE
UND
ENZYME
........................................................
111
8.3
VEKTOREN
........................................................................................................................
113
8.4
OLIGONUKLEOTIDE
..............................................................................................................
114
8.5
ANTIKOERPER
......................................................................................................................
115
8.6
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
..................................................................................................
116
8.7
TABELLENVERZEICHNIS
......................................................................................................
117
8.8
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
................................................................................................
118
ERKLAERUNG
...................................................................................................................................
121
LEBENSLAUF
.................................................................................................................................
122
PUBLIKATIONEN
............................................................................................................................
123
DANKSAGUNG
...............................................................................................................................
124
|
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