Die Funktion der Hook-Proteine in intrazellulären Transportprozessen und bei der Pathogenese der Alzheimerschen Erkrankung:
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2011
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IMAGE 1
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 DIE ALZHEIMERSCHE ERKRANKUNG 1
1.1.1 VERLAUF DER ALZHEIMERSCHEN ERKRANKUNG 1
1.1.2 MOLEKULARE PATHOLOGIE DER ALZHEIMERSCHEN ERKRANKUNG 3
1.2 INTRAZELLULAERER TRANSPORT 6
1.2.1 MIKROTUBULI-BASIERTER TRANSPORT 6
1.2.2 TRANSPORTSTOERUNGEN BEI DER ALZHEIMERSCHEN ERKRANKUNG 8
1.3 HOOK-PROTEINE 9
1.3.1 AUFBAU DER HOOK-PROTEINE 10
1.3.2 HOOK-PROTEINE IM INTRAZELLULAEREN TRANSPORT 10
1.3.3 HOOK-PROTEINE BEI DER ALZHEIMERSCHEN ERKRANKUNG 12
1.4 AUFGABENSTELLUNG 12
2 MATERIAL UND METHODEN 14
2.1 GERAETE UND CHEMIKALIEN 14
2.2 BIOLOGISCHES MATERIAL 14
2.2.1 HIRNGEWEBE 14
2.2.2 MIKROORGANISMEN UND ZELLLINIEN 16
2.3 HOMOGENISIERUNG DES HIRNGEWEBES 16
2.4 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 17
2.4.1 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 17
2.4.2 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 17 2.4.3 WESTERN
BLOT 18
2.4.4 IMMUNDETEKTION AUF MEMBRANEN 18
2.5 ELISAZUM NACHWEIS VON PROTEINEN IM GEHIRNHOMOGENAT 20
2.6 KONSTRUKTION DER PLASMIDE 21
2.6.1 RESTRIKTIONSVERDAU UND LIGATION VON PEGFPHI UND PEGFPH2 22
2.6.2 KLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN IN DEN VEKTOR PEGFP-C2 24
2.7 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 26
2.7.1 KULTIVIERUNG VON ZELLEN 26
2.7.2 ZELLZAHLBESTIMMUNG 27
2.7.3 TRANSFEKTION VON EXPRESSIONSVEKTOREN 27
2.7.4 TRANSFEKTION VON SIRNA 28
2.8 KOIMMUNOPRAEZIPITATION 28
2.9 ZELLVITALITAETS-UNTERSUCHUNG 29
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/1013183827
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.10 ENDOZYTOSE-UNTERSUCHUNG 30
2.11 IMMUNZYTOCHEMIE 30
2.12 DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION 31
3 ERGEBNISSE 33
3.1 UNTERSUCHUNGEN AN HUMANEM POST MORTEM HIRNGEWEBE 33
3.1.1 WESTERN BLOT-ANALYSE 33
3.1.2 HOOK-QUANTIFIZIERUNG MITTELS ELISA 35
3.1.3 NACHWEIS DER ASSOZIATION VON HOOK-PROTEINEN MIT HYPERPHOSPHORY-
LIERTEMTAU 36
3.2 KOIMMUNOPRAEZIPITATION VON HOOK-PROTEINEN MIT TAU 37
3.3 EXPRESSION VON GFP-HOOK-PROTEINEN IN HELA-ZELLEN 38
3.3.1 KONSTRUKTION DER PLASMIDE FUER GFP-HOOK-DELETIONSVARIANTEN 38 3.3.2
NACHWEIS DER GFP-HOOK-EXPRESSION IN HELA-ZELLEN 42
3.3.3 VITALITAETS-UNTERSUCHUNG 44
3.4 AUSWIRKUNGEN DER GFP-HOOK-EXPRESSION 46
3.4.1 ENDOZYTOSE VON TRANSFERRIN 46
3.4.2 ENDOZYTOSE VON EGF 51
3.4.3 LOKALISATION VON ZELLORGANELLEN 53
3.4.4 MIKROTUBULI-ORGANISATION 55
3.4.5 INTEGRITAET DES DYNEIN-DYNACTIN-KOMPLEXES 56
3.5 AUSWIRKUNGEN EINER REDUKTION DER HOOK-EXPRESSION MITTELS SIRNA 59
3.5.1 ENDOZYTOSE VON EGF UND LOKALISATION VON ZELLORGANELLEN 61 3.5.2
INTEGRITAET DES DYNEIN-DYNACTIN-KOMPLEXES 64
4 DISKUSSION 66
4.1 METHODENDISKUSSION 66
4.1.1 PROTEINQUANTIFIZIERUNG IM POST MORTEM HIRNGEWEBE 66
4.1.2 KOIMMUNOPRAEZIPITATION 68
4.1.3 EXPRESSION VON GFP-HOOK-FUSIONSPROTEINEN 68
4.1.4 REDUKTION DER PROTEINEXPRESSION MITTELS SIRNA 69
4.2 UNTERSUCHUNGEN AN HUMANEM POST MORTEM HIRNGEWEBE 70
4.3 EINFLUSS DER HOOK-PROTEINE AUF INTRAZELLULAERE TRANSPORTPROZESSE 73
4.3.1 TRANSPORTINHIBITION DURCH GFP-HOOK-EXPRESSION 73
4.3.2 TRANSPORTMODULATION DURCH VERRINGERUNG DER HOOK-EXPRESSION 75
4.4 BEDEUTUNG DER VERAENDERTEN HOOK-PROTEINEXPRESSION FUER DIE PATHOGENESE
DER ALZHEIMERSCHEN ERKRANKUNG 78
4.5 AUSBLICK 79
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
5 ZUSAMMENFASSUNG 81
6 SUMMARY 83
7 LITERATUR 85
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 100
ANHANG 102
LEBENSLAUF 104
PUBLIKATIONSLISTE 105 |
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