Charakterisierung zellulärer und molekularer Interaktionen von Nierenkarzinomzellen mit dem humanen Knochenmark:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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2011
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2.2
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
................................................................................................
23
2.2.1
KULTIVIERUNG
HUMANER
ZELLLINIEN
...............................................................................
23
2.2.1.1
RENALE
ZELLLINEN
....................................................................................................
23
2.2.1.2
KNOCHENMARKZELLLINIEN
..........................................................................................
24
2.2.2
ISOLIERUNG
UND
KULTIVIERUNG
PRIMAERER
OSTEOBLASTEN
..............................................
25
2.2.3
ISOLIERUNG
VON
MONONUKLEAEREN
ZELLEN
AUS
PHERIPHEREM
BLUT
UND
DIFFERENZIERUNG
ZU
REIFEN
OSTEOKLASTEN
..................................................................
27
2.2.4
ISOLIERUNG
UND
KULTIVIERUNG
VON
PRIMAEREN
RENALEN
TUMORZELLEN
..........................28
2.2.5
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
........................................................................
28
2.2.6
ABLOESEN
UND
PASSAGIEREN
VON
ZELLEN
.....................................................................
29
2.2.7
HERSTELLUNG
KONDITIONIERTER
MEDIEN
.........................................................................
29
2.3
FUNKTIONELLE
ANALYSEN
......................................................................................................
30
2.3.1
UNTERSUCHUNG
DER
ZELL-ADHAESION
.............................................................................
30
2.3.1.1
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DER
ZELL-SUBSTRAT-ADHAESION
.................................................
30
2.3.1.2
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DER
ZELL-ZELL-ADHAESION
........................................................
31
2.3.1.3
INHIBITIONS-ASSAY
ZUR
ANALYSE
DER
VERMITTELTEN
ZELL-ADHAESION
.............................
32
2.3.2
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DER
ZELLMIGRATION
..................................................................
33
2.3.2.1
WUNDHEILUNGSVERSUCH
...........................................................................................
33
2.3.2.2
TRANSMIGRATIONSVERSUCH
........................................................................................
33
2.3.2.3
ELIMINIERUNG
DER
SUBSTANZEN
IM
KONDITIONIERTEN
MEDIUM
....................................
34
2.3.2.4
ULTRAFILTRATION
DES
OSTEOBLASTEN-KONDITIONIERTEN
MEDIUMS
...................................
35
2.3.2.5
BEHANDLUNG
DES
OSTEOBLASTEN-KONDITIONIERTEN
MEDIUMS
MIT
PROTEASE
INHIBITOREN
UND
FUNKTIONSBLOCKIERENDEN
ANTIKOERPERN
...........................................
35
2.4
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
....................................................................................
36
2.4.1
PRIMER
UND
PRIMERDESIGN
.........................................................................................
36
2.4.2
ISOLIERUNG
VON
RNA
..................................................................................................
39
2.4.3
CDNA-SYNTHESE
........................................................................................................
40
X
2.4.4
RT-PCR
.....................................................................................................................
41
2.4.5
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
...................................................................................
42
2.4.6
QUANTITATIVE
REAL-TIME-PCR
...................................................................................
42
2.4.7
MICROARRAYS
...............................................................................................................
44
2.4.8
KNOCKDOWN
VON
DYSADHERIN
IN
RCC-ZELLEN
MITTELS
SIRNA
....................................
50
2.5
PROTEINBIOCHEMISCHE
UND
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
............................................
52
2.5.1
HERSTELLUNG
VON
ZELLLYSATEN
.....................................................................................
52
2.5.2
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
..................................................................
53
2.5.3
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
............................................
53
2.5.4
ANTIKOERPER
..................................................................................................................
55
2.5.4.1
PRIMAERE
ANTIKOERPER
................................................................................................
55
2.5.4.2 SEKUNDAERE
ANTIKOERPER
..........................................................................................
56
2.5.5
WESTERN
BLOT
.............................................................................................................
57
2.5.6
LI-COR
ODYSSEY
INFRARED
IMAGING
SYSTEM
...........................................................
58
2.5.7
CYTOKINE
ARRAY
..........................................................................................................
59
2.5.8
ENZYMGEKOPPELTER
IMMUNOSORBENT
ASSAY
(ELISA)
.............................................62
2.5.9
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG
......................................................................63
2.6
STATISTIK
................................................................................................................................
64
3
ERGEBNISSE
.........................................................................................................
65
3.1
CHARAKTERISIERUNG
IN
VITRO
GEREIFTER
OSTEOKLASTEN
.....................................................65
3.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
PRIMAEREN
RCC-KULTUREN
..........................................................
67
3.3
FUNKTIONELLE
ANALYSEN
ZUR
UNTERSUCHUNG
DER
METASTASIERUNG
VON
RCC
ZELLEN
IN
DAS
KNOCHENMARK
...........................................................................................
69
3.3.1
INTERAKTIONEN
VON
RCC-ZELLEN
UND
DER
IM
KNOCHENMARK
SEZERNIERTEN
MATRIX
........................................................................................................................69
3.3.2
ZELL-ZELL-INTERAKTION
VON
RCC-ZELLEN
UND
DEM
KNOCHENMARK
...........................
73
XI
3.3.3
DER
EINFLUSS
SEZERNIERTER
FAKTOREN
DER
KNOCHENMARKZELLEN
AUF
DIE
MIGRATION
DER
RCC-ZELLEN
.......................................................................................
77
3.3.4
OSTEOBLASTEN-SEZERNIERTE
FAKTOREN
ERHOEHEN
DIE
MIGRATION
DER
RCC-ZELLEN
....79
3.3.5
CHARAKTERISIERUNG
SEZERNIERTER
SUBSTANZEN
IM
OSTEOBLASTEN-KONDI
TIONIERTEN
MEDIUM
....................................................................................................
85
3.3.5.1
DENATURIERUNG
PROTEINOGENER
SUBSTANZEN
...........................................................
85
3.3.5.2
ENTFERNUNG
VON
LIPIDEN
DURCH
AKTIVKOHLE-BEHANDLUNG
........................................
86
3.3.5.3
ELIMINIERUNG
VON
ZUCKERHALTIGEN
VERBINDUNGEN
DURCH
BEHANDLUNG
MIT
CON
A-SEPHAROSE
..........................................................................................................
87
3.3.5.4
FRAKTIONIERUNG
DES
OSTEOBLASTEN-KONDITIONIERTEN
MEDIUMS
MITTELS
ULTRAFILTRATION
..........................................................................................................
88
3.3.5.5
INHIBIERUNG
VON
PROTEASEN
IM
OSTEOBLASTEN-KONDITIONIERTEN
MEDIUM
..................
89
3.4
DER
EINFLUSS
VON
OSTEOBLASTEN-SEZERNIERTEN
FAKTOREN
AUF
DIE
GENEXPRESSION
DER
RCC-ZELLEN
.....................................................................................
91
3.4.1
RT-PCR-ANALYSEN
DER
MATRIX-METALLOPROTEINASEN
...............................................
91
3.4.2
GENEXPRESSIONSANALYSEN
MIT
SIGNALWEG-SPEZIFISCHEN
MICROARRAYS
.....................
93
3.5
DIE
EXPRESSION
VON
DYSADHERIN
IN
DEN
RCC-ZELLEN
...................................................99
3.6
DIE
FUNKTION
VON
DYSADHERIN
........................................................................................105
3.6.1
INHIBIERUNG
VON
DYSADHERIN
MITTELS
ANTIKOERPERBEHANDLUNG
..............................
105
3.6.2
KNOCKDOWN
VON
DYSADHERIN
IN
RCC-ZELLEN
MITTELS
SIRNA
...............................
107
3.6.3
DER
EINFLUSS
DES
KNOCKDOWNS
VON
DYSADHERIN
AUF
DIE
MIGRATION
DER
RCC-ZELLEN
...........................................................................................................
110
3.7
DIE
EXPRESSION
TUMORZELL-SEZERNIERTER
FAKTOREN
NACH
KULTIVIERUNG
IN
OSTEOBLASTEN-KONDITIONIERTEM
MEDIUM
.....................................................................
111
3.7.1
ANALYSE
RCC-ZELL-SEZERNIERTER
ZYTOKINE/CHEMOKINE
UNTER
EINFLUSS
VON
OSTEOBLASTEN
...........................................................................................................
111
3.7.2
DAS
CHEMOTAKTISCHE
POTENTIAL
DER
RCC-ZELLEN
NACH
NEUTRALISIERUNG
VON
CCL2
UND
ANDEREN
VERAENDERTEN
CHEMOKINEN
....................................................
116
3.8
DER
EINFLUSS
VON
DYSADHERIN
AUF
DIE
CCL2-SEZERNIERUNG
DER
RCC-ZELLEN
........
120
XII
4
DISKUSSION
.......................................................................................................
122
4.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
PRIMAEREN
ZELLKULTUREN
............................................................
123
4.2
DIE
INTERAKTIONEN
VON
NIERENKARZINOMZELLEN
IM
KNOCHENMARK
..........................
126
4.3
DIE
KNOCHENMARK-MIKROUMGEBUNG
ALS
GEEIGNETE
NISCHE
ZUR
ANSIEDLUNG
VON
RCC-ZELLEN
..............................................................................................................127
4.4
OSTEOBLASTEN-SEZERNIERTE
FAKTOREN
HABEN
EINE
MIGRATIONSFOERDERNDE
WIRKUNG
AUF
RCC-ZELLEN
...............................................................................................
129
4.5
OSTEOBLASTEN-SEZERNIERTE
FAKTOREN
VERAENDERN
DIE
GENEXPRESSION
IN
DEN
RCC-ZELLEN
......................................................................................................................
133
4.5.1
OSTEOBLASTEN-SEZERNIERTE
FAKTOREN
INDUZIEREN
DIE
EXPRESSION
VON
MATRIX
METALLOPROTEINASEN
................................................................................................
133
4.5.2
OSTEOBLASTEN-SEZERNIERTE
FAKTOREN
ERHOEHEN
DIE
DYSADHERIN-EXPRESSION
IN
RCC-ZELLEN
............................................................................................................
135
4.5.3
OSTEOBLASTEN-SEZERNIERTE
FAKTOREN
ERHOEHEN
DIE
CCL2-SEZERNIERUNG
IN
DEN
RCC-ZELLEN
...........................................................................................
137
4.6
DYSADHERIN
BEEINFLUSST
DIE
CCL2-EXPRESSION
IN
DEN
RCC-ZELLEN
........................
138
4.7
AUSBLICK
............................................................................................................................
139
5
.
ZUSAMMENFASSUNG
...................................................................................
141
SUMMARY
...............................................................................................................
142
LITERATURVERZEICHNIS
.....................................................................................
143
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
................................................................................
153
PUBLIKATIONEN
....................................................................................................
157
LEBENSLAUF
.........................................................................................................
159
XIII
|
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