Untersuchungen der Flagellen von Pyrococcus furiosus: Flagellenvermittelte Interaktionen, Ultrastruktur und Molekularbiologie
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IMAGE 1
UNTERSUCHUNGEN DER FLAGELLEN VON
PYROCOCCUS FURIOSUS:
FLAGELLENVERMITTELTE INTERAKTIONEN,
ULTRASTRUKTUR UND MOLEKULARBIOLOGIE
DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.)
DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET III
- BIOLOGIE UND VORKLINISCHE MEDIZIN
DER UNIVERSITAET REGENSBURG
VORGELEGT VON
SIMONE SCHOPF
AUS ST. OSWALD-RIEDLHUETTE
MAERZ 2011
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/101409870X
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
INHALT
INHALT
EINLEITUNG 1
1.1 MIKROBIELLE ZELLANHAENGE UND IHRE FUNKTION 1
1.2 DIE FLAGELLEN VON PYROCOCCUS FURIOSUS 3
1.2.1 EINE BETRACHTUNG AUF GENEBENE 4
1.2.2 EINE BETRACHTUNG AUF PROTEINEBENE 5
12.3 EINE BETRACHTUNG AUF FUNKTIONELLER EBENE 6
1.3 COKULTUREN AUF DER BASIS EINER H 2 -SYNTROPIE 7
1.4 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 9
MATERIAL UND METHODEN 10
2.1 SUBSTANZEN UND BEZUGSQUELLEN 10
2.1.1 CHEMIKALIEN 10
2.1.2 ENZYME 11
2.1.3 VEKTOREN 12
2.1.4 ANTIKOERPER 12
2.1.5 MOLEKULARMASSENSTANDARDS 13
2.1.6 ANTIBIOTIKA 13
2.1.7 OLIGONUKLEOTIDE 14
2.1.8 REAKTIONSKITS 15
2.1.9 VERBRAUCHSGEGENSTAENDE 15
2.1.10 GERAETE 16
2.1.11 MATERIALIEN FUER AUFWACHSVERSUCHE 17
2.2 KULTURMEDIEN 18
2.2.1 HERSTELLUNG AEROBER MEDIEN 18
2.2.2 LURIA-BERTANI (LB) MEDIUM FUERE. COLI 19
2.2.3 SOB-MEDIUM 19
2.2.4 HERSTELLUNG ANAEROBER MEDIEN 19
2.2.5 SME-MEDIUM FUER P. FURIOSUS, M. KANDLERI UND DIE COKULTUR 20
2.3 VERWENDETE ORGANISMEN 21
2.4 KULTIVIERUNG 22
2.4.1 WACHSTUMSBEDINGUNGEN DER ORGANISMEN 22
2.4.2 KULTIVIERUNG VON E. COLI-STAEMMEN 22
2.4.3 KLEINANZUCHTEN VON P. FURIOSUS, M. KANDLERI UND DER COKULTUR. 22
2.4.4 ANZUCHT VON ORGANISMEN AUF FESTEN OBERFLAECHEN 23
2.4.5 ANLEGEN VON GLYCERINKULTUREN 23
2.5 STERILISATION 23
IMAGE 3
INHALT
2.6 MIKROSKOPIE 24
2.6.1 PHASENKONTRAST- UND FLUORESZENZMIKROSKOPIE 24
2.6.2 BESTIMMUNG DER GESAMTZELLZAHL 24
2.6.3 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE (TEM) 24
HERSTELLUNG VON SUSPENSIONSPRAEPARATEN 25
NEGATIVKONTRASTIERUNG 25
TOMOGRAPHIE 25
2.6.4 RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE (REM) 26
2.7 FLUORESZENZFAERBUNGEN 27
2.7.1 DAPI-FAERBUNG 27
2.7.2 FAERBUNG VON ZELLEN MIT ALEXAFLUOR 27
2.7.3 KOPPLUNG VON ANTIKOERPERN MIT ALEXAFLUOR 27
2.8 ISOLIERUNG UND ANALYTIK VON NUKLEINSAEUREN 28
2.8.1 ALLGEMEINE HINWEISE ZUM UMGANG MIT RNA 28
2.8.2 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS P. FURIOSUS 28
2.8.3 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS P. FURIOSUS 29
2.8.4 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E.COLI 29
2.8.5 ETHANOLFAELLUNG VON NUKLEINSAEUREN 29
2.8.6 BESTIMMUNG DER KONZENTRATION VON NUKLEINSAEUREN 29
2.8.7 NATIVE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE ZUR ANALYTIK VON DNA 30
2.8.8 DENATURIERENDE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE ZUR RNA-ANALYTIK 30
2.8.9 DENATURIERENDE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE FUER NORTHERN BLOT 31
2.9 POLYMERASE-CHAIN-REACTION (PCR) 32
2.9.1 DURCHFUEHRUNG EINER PCR 32
2.9.2 AMPLIFIKATION VON GENEN FUER ANSCHLIESSENDE KLONIERUNG 32
2.9.3 KOLONIE-PCR 33
2.9.4 AMPLIFIKATION ARCHAEELLER 16S RRNA-GENE 33
2.9.5 AMPLIFIKATION VON CDNA FUER IN VITRO-TRANSKRIPTION 34
2.10 REVERSE TRANSKRIPTION 35
2.11 BLOTTING VON NUKLEINSAEUREN 36
2.11.1 DIG-MARKIERUNG VON RNA-SONDEN 36
2.11.2 DURCHFUEHRUNG DES NORTHERN BLOTS 36
2.11.3 FAERBUNG VON BLOT-MEMBRANEN 38
2.11.4 FIXIERUNG VON NUKLEINSAEUREN AUF BLOT-MEMBRANEN 38
2.11.5 HYBRIDISIERUNG MIT DIG-MARKIERTEN RNA-SONDEN 38
2.11.6 DETEKTION UEBER CHEMILUMINESZENZ 39
IMAGE 4
INHALT
2.12 KLONIERUNG 39
2.12.1 REINIGUNG VON PCR-FRAGMENTEN 40
2.12.2 RESTRIKTIONSVERDAU UND LIGATION 40
2.12.3 HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN 40
ELEKTROKOMPETENTE ZELLEN 40
CHEMISCH KOMPETENTE ZELLEN 41
2.12.4 TRANSFORMATION 41
ELEKTROPORATION 41
HEATSHOCK 42
2.12.5 SCREENING VON TRANSFORMANTEN 42
2.12.6 DNA-SEQUENZIERUNG UND SEQUENZDATENANALYSE 43
2.13 ISOLIERUNG VON ZELLKOMPONENTEN 43
2.13.1 ZELLAUFSCHLUSS VON P. FURIOSUS 43
2.13.2 ZELLAUFSCHLUSS VON M. KANDLERI 44
2.13.3 ISOLIERUNG DER OBERFLAECHENPROTEINE VON M. KANDLERI 44
2.13.4 PRAEPARATION DES S-LAYERS VON P. FURIOSUS 44
2.14 PRAEPARATION DER FLAGELLEN VON P. FURIOSUS 45
2.14.1 ZELLLYSE UND DIFFERENTIELLE ZENTRIFUGATION 45
2.14.2 SOLUBILISIERUNG DER MEMBRANPROTEINE 46
2.14.3 CSCI-DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION 46
2.14.4 ISOLIERUNG UND DIALYSE DER FRAKTIONEN 47
2.15 POLYMERISATIONSSTUDIE AN FLAGELLEN 47
2. 15.1 DEPOLYMERISATION 47
2.15.2 REPOLYMERISATION VON MONOMEREN 47
2.16 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 48
2.16.1 BESTIMMUNG VON PROTEINKONZENTRATIONEN 48
2.16.2 TCA-FAELLUNG 48
2.16.3 DISKONTINUIERIICHE SDS-PAGE NACH LAEMMLI (1970) 48
2.16.4 2-DIMENSIONALE SDS-PAGE 49
2.16.5 HIGH RESOLUTION CLEAR NATIVE ELECTROPHORESIS (WITTIG ET AL.,
2007) 50
2.16.6 FAERBUNG VON SDS-GELEN 52
COOMASSIE-FAERBUNG 52
SILBERFAERBUNG 52
2.16.7 AUFBEWAHRUNG VON SDS-GELEN 53
2.16.8 PROTEINSEQUENZIERUNG 54
N-TERMINALE SEQUENZIERUNG 54
IN-GEL-VERDAU UND MALDI-TOF MS/MS 54
IMAGE 5
INHALT
2.16.9 BIOINFORMATISCHE ANALYSEN 54
2.17 BLOTTING VON PROTEINEN 55
2.17.1 EIN-PUFFERSYSTEM NACH TOWBIN ETAL. (1979) 55
2.17.2 DREI-PUFFER SYSTEM NACH KYHSE-ANDERSON (1984) 55
2.17.3 FAERBUNG VON PDVF MEMBRANEN 56
2.18 EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE 56
2.18.1 PROTEINEXPRESSION IM IMPACT-CN-SYSTEM 56
2.18.2 PROTEINEXPRESSION IM PET-SYSTEM 57
2.19 IMMUNOLOGISCHE METHODEN 58
2.19.1 HERSTELLUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER GEGEN ZELLOBERFLAECHENPROTEINE
58
2.19.2 AUFREINIGUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER 59
2.19.3 ABSAETTIGUNG POLYKLONALER ANTIKOERPERLOESUNGEN 59
2.19.4 IMMUNO-FLUORESZENZMARKIERUNG ADHAERIERENDER ZELLEN 60
2.19.5 IMMUNOBLOT 60
2.19.6 IMMUNMARKIERUNG FUER DIE ELEKTRONENMIKROSKOPIE 61
3 ERGEBNISSE 63
3.1 FLAGELLENVERMITTELTE INTERAKTIONEN BEI P. FURIOSUS 63
3.1.1 OPTIMIERUNG DER GASPHASE FUER DIE COKULTUR 63
3.1.2 BIOFILMBILDUNG DER COKULTUR AUF OBERFLAECHEN 65
3.1.3 ZEITABHAENGIGE ENTWICKLUNG DES BIOFILMS 66
3.1.4 ANALYSE DER DREIDIMENSIONALEN BIOFILMSTRUKTUR 67
3.2 VERAENDERUNG DES ADHAESIONSVERHALTENS VON P. FURIOSUS 72
3.3 AUFREINIGUNG DER FLAGELLEN VON P. FURIOSUS 78
3.3.1 ABSCHEREN DER ZELLANHAENGE MIT DEM ULTRATURRAX 78
3.3.2 PHASENSEPARATION MIT TRITON X-114 (KALMOKOFFET AL., 1988) 80
3.3.3 SOLUBILISIERUNG MIT NONIDET P40 81
EXPERIMENTELLE DURCHFUEHRUNG 81
ANALYSE DER FLAGELLENFRAKTION 82
3.3.4 SOLUBILISIERUNG MIT DDM 83
EXPERIMENTELLE DURCHFUEHRUNG 83
ANALYSE DER FLAGELLENFRAKTION 84
3.4 ANALYSE F LAGELLENASSOZIIERTER STRUKTUREN 86
3.4.1 ANALYSE IM TEM 86
3.4.2 IDENTIFIKATION AUSGEWAEHLTER PROTEINBANDEN 88
3.4.3 ULTRADUENNSCHNITTE VON LABORSTAMM-ZELLEN 89
3.4.4 TOMOGRAPHIE DER TUBES 91
IMAGE 6
INHALT
3.5 CHARAKTERISIERUNG DER FLAGELLEN 94
3.5.1 BIOINFORMATISCHE ANALYSEN 94
3.5.2 ANALYSE DURCH IMMUNOLOGISCHE METHODEN 96
3.5.3 ANALYSE UEBER NATIVE GELELEKTROPHORESE 98
3.6 DE- UND REPOLYMERISATIONSVERSUCHE AN FLAGELLEN VON P. FURIOSUS 100
3.6.1 DEPOLYMERISATION DER FLAGELLEN 700
3.6.2 STUDIEN ZUR REPOLYMERISATION 102
3.7 KLONIERUNG VON FLABO 105
3.7.7 KLONIERUNGSSTRATEGIE IM IMPACT-CN-SYSTEM 705
3.7.2 KLONIERUNGSSTRATEGIE IM PET-SYSTEM 707
3.8 NORTHERN BLOTTING 110
4 DISKUSSION 112
4.1 COKULTUR AUS P. FURIOSUS UND M. KANDLERI 112
4.7.7 FLAGELLENVERMITTELTE INTERAKTIONEN 772
4.1.2 ENTWICKLUNG DES BI-SPEZIES-BIOFILMS 774
4.7.3 ANTIKOERPER GEGEN OBERFLAECHENSTRUKTUREN 775
4.2 MIKROBIELLE ADHAESION 116
4.2.1 MIKROBIELLE ADHAESION ALS MULTIFAKTORISCHES EREIGNIS 776
4.2.2 DIE ROLLE DER OBERFLAECHE FUER DIE BIOFILMARCHITEKTUR 776
4.2.3 VERAENDERUNG DES ADHAESIONSVERHALTENS VON P. FURIOSUS 778
4.3 FLAGELLEN VON P. FURIOSUS 119
4.3.7 UNTERSUCHUNGEN AN FLAGELLEN 779
4.3.2 ANALYSE FLAGELLENASSOZIIERFER STRUKTUREN 720
4.3.3 DE- UND REPOLYMERISATION 722
4.3.4 KLONIERUNG UND NORTHERN BLOTTING 724
5 ZUSAMMENFASSUNG 125
6 ANHANG 126
6.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 126
6.2 SEQUENZEN DER FLAGELLINE 127
6.3 SEQUENZIERUNG DES 16S RRNA-GENS VON P. FURIOSUS LABORSTAMM 128 6.4
CURRICULUM VITAE 129
6.5 PUBLIKATIONEN 130
6.6 TAGUNGSBEITRAEGE 130
7 LITERATURVERZEICHNIS 131 |
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