Die Rolle des Mia40/Erv1-Disulfid-Transfersystems in der Biogenese von mitochondrialem Ccs1 und Sod1:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
München
Hieronymus
2011
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| Schriftenreihe: | Biologie
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1 . 1 MITOCHONDRIEN 1
1 . 2 PROTEINIMPORT IN MITOCHONDRIEN 2
1 . 3 TRANSLOKASE DER AEUSSEREN MITOCHONDRIALEN MEMBRAN 2
1.3.1 TOM-KOMPLEX 3
1.3.2 TOB-KOMPLEX 3
1.4 DLETRANSLOKASEN DER INNEREN MITOCHONDRIALEN MEMBRAN 4
1.4.1 TIM22-KOMPLEX 4
1.4.2 TIM23-KOMPLEX 5
1.4.3 OXA-TRANSLOKASE 6
1 . 5 TRANSLOKATION IN DEN INTERMEMBRANRAJM 6
1.5.1 DAS MIA40/ERVL-DLSULFID-TRANSFERSYSTEM 8
1.5.1.1 MIA40 8
1.5.1.2 ERVL 10
1.5.1.3 IMPORT VON SUBSTRATEN UEBER DAS DISULFID-TRANSFERSYSTEM 11
1 . 6 SUPEROXID-DISMUTASE 1 1 5
1 . 7 CCSL - DAS KUPFER-CHAPERON VON S O D I 1 9
1 . 8 FRAGESTELLUNG DER ARBEIT 2 2
2 M A T E R I A L UND METHODEN 2 3
2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 23
2.1.1 VERWENDETE PLASMIDE 23
2.1.2 ISOLIERUNG VON PLASMLD-DNS AUS E.COLI 23
2.1.3 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 24
2.1.4 VERWENDETE PRIMER 25
2.1.5 KLONIERUNGSSTRATEGIEN 25
2.1.6 DNS REINIGUNG UND ANALYSE 26
2.1.7 RESTRIKTIONSVERDAU 27
2.1.8 LIGATION 27
2.1.9 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER ZELLEN 27
2.1.10 TRANSFORMATION ELEKTROKOMPETENTER E.CO//-ZELLEN 28
2 . 2 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 2 9
2.2.1 VERWENDETE F.CO/I-STAEMME 29
2.2.2 VERWENDETE MEDIEN FUER DIE ANZUCHT VON E.COLI 29
2.2.3 REKOMBINANTE PROTEINEXPRESSION IN E.COLI (LB-MEDIUM) 30
2.2.4 EXPRESSION RADIOAKTIV MARKIERTER PROTEINE IN E.COLI (LOW SULFATE
MEDIUM) 30
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IMAGE 2
2.2.5 GLUTATHLON-AFFINITAETSCHROMATOGRAFIE 30
2.2.6 SDS-POLYACRYLAMID GELELEKTROPHORESE (SOS-PAGE) 3 1
2.2.7 TRANSFER VON PROTEINEN AUF EINE NITROZELLULOSEMEMBRAN 32
2.2.8 AUTORADIOGRAFIE UND DENSITOMETRIE 32
2.2.9 NICKEL-NTA PRAEZIPITATION VON OCTAHISTIDYLMARKIERTEN PROTEINEN
(HIS-PULLDOWN) 32
2.2.10 HARNSTOFFDENATURIERUNG VON PROTEINEN 33
2.2.11 FAELLUNG VON PROTEINEN MIT TRICHLORESSIGSAEURE (TCA) 33
2.2.12 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION (BRADFORDTEST) 33
2.2.13 PROTEINMODIFIKATION 34
2.2.13.1 PROTEINMODIFIKATION MIT
4-ACETAMIDO-4-MALEIMIDYLSTILBENE-2,2-DISULFONSAEURE (AMS) 34
2.2.13.2 PROTEINMODIFIKATION MIT LODOACETAMID (IAA) 34
2.2.14 CHEMISCHE QUERVERNETZUNG VON PROTEINEN 34
2 . 3 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 3 5
2.3.1 VERWENDETE HEFESTAEMME 35
2.3.2 VERWENDETE MEDIEN FUER HEFEKULTUREN 36
2.3.3 HEFEKULTIVIERUNG 36
2.3.4 HERSTELLUNG VON GLYZEROLSTOCKS 36
2.3.5 GEWINNUNG VON GESAMTZELLPROTEIN 37
2.3.6 ISOLIERUNG VON MITOCHONDRIEN AUS HEFE 37
2.3.7 PROTEINIMPORT VON CCSL IN ISOLIERTE MITOCHONDRIEN 38
2.3.8 TRYPSINBEHANDLUNG 38
2.3.9 PRAEPARATION VON MITOPLASTEN 38
2 . 4 IMMUNOLOGISCHE METHODEN 3 9
2.4.1 GENERIERUNG VON ANTIKOERPERN 39
2.4.2 ERZEUGUNG VON SERUM AUS BLUT 39
2.4.3 REINIGUNG DER ANTIKOERPER 39
2.4.4 IMMUNODEKORATION VON PROTEINEN AUF NITROZELLULOSEMEMBRAN 4 1
2.4.5 IMMUNOPRAEZIPITATION 4 1
3 ERGEBNISSE 43
3.1 SODL UND CCSL BESITZEN KEINE MITOCHONDRIALE TARGETINGSEQUENZ 43
3 . 2 HERSTELLUNG VON ANTIKOERPERN GEGEN CCSL UND S O D I 4 3
3.2.1 SPEZIFITAET DER ANTISEREN UND AFFINITAETSGEREINIGTEN ANTIKOERPER
GEGEN CCSL UND SODL 44
3.3 MITOCHONDRIALES CCSL ENTHAELT DISULFIDBROCKEN 46
3.4 DIE PROTEINMENGEN VON CCSL UND S O D I IM I M R DER MITOCHONDRIEN
SIND VOM MIA40/ERV1-DISULFIDTRANSFERSYSTEM ABHAENGIG 4 7
3.5 DIE ROLLE DES DISULFID-TRANSFERSYSTEMS FUER DEN IMPORT VON CCSL 50
3.5.1 IMPORT VON CCSL IN ISOLIERTE MITOCHONDRIEN 50
3.5.1.1 HERSTELLUNG VON REKOMBINANTEM CCSL 50
IMAGE 3
3.5.1.2 REKOMBINANTES CCSL WIRD IN DEN IMR ISOLIERTER MITOCHONDRIEN
IMPORTIERT 51
3.5.1.3 TEMPERATURABHAENGIGKEIT DES CCSL IMPORTS 52
3.5.1.4 KINETIK DES IMPORTS VON CCSL 53
3.5.1.5 EINE FRAKTION DES REKOMBINANTEN CCSL WIRD UNVOLLSTAENDIG IN DIE
MITOCHONDRIEN IMPORTIERT 54
3.5.1.6 REDUZIERENDE BEDINGUNGEN BEEINTRAECHTIGEN DEN IMPORT VON CCSL IN
MITOCHONDRIEN 55
3 . 5 . 2 MIA40 IST FUER DEN IMPORT VON CCSL NOTWENDIG 5 6
3.6 CCSL INTERAGIERT MIT M I A 4 0 59
3.6.1 CCSL BILDET EIN HOCHMOLEKULARES QUERVERNETZUNGSADDUKT 59
3.6.2 CCSL BILDET ADDUKTE UEBER EINE DISULFIDBRUECKE 60
3.6.3 ENDOGENES CCSL BILDET EIN INTERMEDIAT MIT MIA40 63
3.6.4 MLA40 BILDET EIN INTERMEDIAT MIT IMPORTIERTEM CCSL UEBER EINE
DISULFIDBRUECKE 64
3.6.5 CCSL INTERAGIERT NICHT MIT ERVL 65
4 DISKUSSION 67
4.1 IMPORT VON CCSL UND S O D I IN MITOCHONDRIEN 67
4 . 2 CCSL IST EIN UNTYPISCHES SUBSTRAT VON M I A 4 0 6 9
4.2.1 DIE CYSTEINRESTE IN CCSL WEISEN WEDER EIN TWIN CX 3C-NOCH EIN TWIN
CXGC-MOTIV AUF 69
4.2.2 CCSL IST DAS BISLANG GROESSTE SUBSTRAT VON MIA40 70
4.2.3 CCSL BILDET EIN UNGEWOEHNLICH STABILES INTERMEDIAT MIT MIA40 7 1
4 . 3 VERGLEICH MIT ANDEREN DISULFIDBROCKEN BILDENDEN SYSTEMEN 7 2
4 . 4 BILDUNG VON DISULFIDBROCKEN IM ZYTOSOLISCHEN CCSL UND S O D I 7 4
4.5 AKTIVIERUNG VON S O D I UNABHAENGIG VON CCSL 7 4
4 . 6 LOKAUSATION VON S O D I UND CCSL 75
4.6.1 MECHANISMEN DER DUALEN LOKALISATION 75
4.6.1.1 VENWENDUNG ZWEIER STARTCODONS 76
4.6.1.2 ROLLE VON ABSPALTBAREN N-TERMINALEN SIGNALSEQUENZEN BEI DUALER
LOKALISATION 76
4.6.2 MISS/ITS - EIN NEUES SIGNALPEPTID FUER DEN TRANSPORT IN DEN IMR 77
4.6.3 VERTEILUNG VON CCSL UND SODI ZWISCHEN ZYTOSOL UND MITOCHONDRIEN 78
5 ZUSAMMENFASSUNG 81
6 LITERATURSTELLEN 83
7 PUBLIKATION 95
8 ABKUERZUNGEN 96
9 GERAETE 98
10 M A T E R I A L I E N 99
DANKSAGUNG 101
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