Funktionelle Charakterisierung des Retromer-vermittelten Proteintransports in Pflanzen:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Aachen
Shaker-Verl.
2010
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| Schriftenreihe: | Biologie
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| Schlagworte: | |
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| Beschreibung: | Literaturangaben S. 123 - 136 |
| Beschreibung: | 141 S. Ill., graph. Darst. 210 mm x 148 mm, 230 g |
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I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 3
1.1 DAS ENDOMEMBRANSYSTEM 3
1.1.1 DAS ENDOPLASMATISCHE RETIKULUM 4
1.1.2 DER GOLGI-APPARAT 6
1.1.3 DIE ENDOSOMALEN KOMPARTIMENTE 6
1.1.4 DIEVAKUOLE 8
1.2 INTRAZELLULAERER TRANSPORT 9
1.2.1 DER SEKRETORISCHE TRANSPORTWEG 10
1.3 DER VAKUOLAERE SORTIERUNGSREZEPTOR BP80 13
1.4 DER RETROMER-KOMPLEX 16
1.5 ZIELSETZUNG 19
2 MATERIAL UND METHODEN 21
2.1 GERAETE, MATERIALEN, CHEMIKALIEN, ENZYME UND KITS 21
2.2 BAKTERIENSTAEMME UND PLASMIDE 21
2.2.1 BAKTERIENSTAEMME 21
2.2.2 VERWENDETE PLASMIDE 21
2.3 DESOXYOLIGONUKLEOTIDE 22
2.4 ANTIKOERPER 23
2.4.1 PRIMAERANTIKOERPER 23
2.4.2 HERSTELLUNG DER PRIMAERANTIKOERPER 24
2.4.3 SEKUNDAERANTIKOERPER 25
2.5 COMPUTERANALYSE VON DNA- UND PROTEINSEQUENZEN 25
2.6 PFLANZENMATERIAL 26
2.6.1 KULTIVIERUNG VON ARABIDOPSIS THALIANA 26
2.6.2 KULTIVIERUNG VON TABAKPFLANZEN IM GEWAECHSHAUS 26
2.6.3 KULTIVIERUNG VON STERILEN TABAKPFLANZEN IN VITRO 26
2.6.4 ZELLKULTUR 28
2.6.4.1 ^RAB/DOPS/S-SUSPENSIONSZELLKULTUR 28
2.6.4.2 BY-2 SUSPENSIONSZELLKULTUR 28
2.7 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 29
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/1009521101
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS _ II
2.7.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 29
2.7.2 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 30
2.7.3 ISOLIERUNG UND AUFREINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 30
2.7.4 SPALTUNG VON DNA DURCH RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 31
2.7.5 DEPHOSPHORYLIERUNG VON PLASMID-DNA 32
2.7.6 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 32
2.7.7 SEQUENZIERUNG VON DNA 33
2.7.8 ANZUCHT VON ESCHERICHIA CO//-KULTUREN 33
2.7.9 HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER BAKTERIENSTAEMME 33
2.7.10 TRANSFORMATION TRANSFORMATIONSKOMPETENTER BAKTERIENSTAEMME VON E.
COLI 34
2.8 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 35
2.8.1 MINI-PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 35
2.8.2 MIDI-PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 36
2.8.3 MAXI-PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 36
2.9 PLASMIDKONSTRUKTIONEN 37
2.9.1 KLONIERUNG DER RETROMERUNTEREINHEITEN 37
2.9.2 HERSTELLUNG DER SNX-MUTANTEN 39
2.9.3 HERSTELLUNG EINES RNAI-KONSTRUKTS 40
2.9.4 KLONIERUNG DER BP80-CNX-KONSTRUKTE 40
2.9.5 KLONIERUNG DES BP80FL-CERULEAN-KONSTRUKTS 41
2.10 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 41
2.10.1 HERSTELLUNG VON PROTOPLASTEN AUS TABAKBLAETTERN 41
2.10.2 HERSTELLUNG VON PROTOPLASTEN AUS SUSPENSIONSKULTURZELLEN 42
2.10.3 TRANSFORMATION VON PROTOPLASTEN DURCH ELEKTROPORATION 43
2.10.4 ERNTEN DER PROTOPLASTEN UND DES MEDIUMS 43
2.10.5 MESSUNG DER ENZYMATISCHEN AKTIVITAET 44
2.11 ALLGEMEINE PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 45
2.11.1 AMMONIUMSULFAT-FAELLUNG VON PROTEINEN 45
2.11.2 GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON PROTEINEN 46
2.11.3 WESTERNBLOT-ANALYSE(LMMUNOBLOT) 47
2.12 IMMUNMARKIERUNG 49
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS III
2.12.1 IMMUNMARKIERUNG VON ARABIDOPSIS THALIANA 49
2.12.2 IMMUNMARKIERUNG VON BY2-SUSPENSIONSKULTUREN 50
2.12.3 IMMUNMARKIERUNG VON BY2-SUSPENSIONSKULTUREN (ABGEWANDEL- TES
PROTOKOLL) 51
2.13 KONFOKALE MIKROSKOPIE 52
2.13.1 PROBENVORBEREITUNG 52
2.13.2 CONFOCAL LASER SCANNING MICROSCOPY (CLSM) 52
3 ERGEBNISSE 55
3.1 IDENTIFIKATION UND STRUKTURELLE CHARAKTERISIERUNG DER KLEINEN
RETROMERUNTEREINHEIT 55
3.2 ANALYSE DER ANTIKOERPER GEGEN SNX1, SNX2A UND VPS35 58
3.3 LOKALISIERUNGSSTUDIEN PFLANZLICHER SORTING NEXINE 60
3.3.1 LOKALISIERUNG DER SORTING NEXINE IN / RA»CFOPS/S-PROTOPLASTEN .60
3.3.2 LOKALISIERUNG DER SORTING NEXINE IN TABAK-PROTOPLASTEN 62
3.3.3 LOKALISIERUNG DER SORTING NEXINE IN BY2-ZELLEN 63
3.3.4 LOKALISIERUNG VON ENDOGENEM SNX2A IN ARABIDOPSIS THALIANA.65
3.4 LOKALISIERUNGSSTUDIEN DER GROSSEN RETROMERUNTEREINHEIT 67
3.5 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DER SORTING NEXINE 69
3.5.1 EINFLUSS DER SNX-MUTANTEN AUF DEN VAKUOLAEREN
SORTIERUNGSREZEPTOR BP80 71
3.5.2 EINFLUSS DER SNX-MUTANTEN AUF DAS PRAEVAKUOLAERE KOMPARTIMENT. 75
3.5.3 EINFLUSS DER SNX-MUTANTEN AUF DEN VAKUOLAEREN TRANSPORTWEG 78
3.5.4 EINFLUSS DER KOEXPRESSION ZWEIER SNX-MUTANTEN AUF DEN VAKUOLAEREN
SORTIERUNGSREZEPTOR BP80 82
3.5.5 EINFLUSS DER KOEXPRESSION BEIDER SNX-MUTANTEN AUF DEN VAKUOLAEREN
TRANSPORTWEG 90
3.6 REZEPTOR-LIGANDEN-INTERAKTION 94
3.6.1 LOKALISIERUNG DER BP80-KONSTRUKTE 96
3.6.2 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DER BP80-KONSTRUKTE 98
3.6.3 BP80 BINDET LIGANDEN BEREITS IM ER 100
3.7 WILDTYP BP80 HAT KEINEN INHIBIERENDEN EFFEKT AUF DEN COPII-
VERMITTELTEN ER-EXPORT 105
4 DISKUSSION 108
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS IY
4.1 LOKALISIERUNG DES RETROMER-KOMPLEXES 108
4.2 DAS RETROMER-VERMITTELTE REZYKLIEREN DES VSRS FINDET AM TGN STATT
111
4.3 DIE SNX-MUTANTEN VERHINDERN DAS ANSCHWELLEN DER PVCS DURCH
WORTMANNIN 112
4.4 DER TRANSPORT VOM TGN ZUR VAKUOLE IST VSR-UNABHAENGIG 114
4.5 DIE INHIBIERUNG DER RETROMER-FUNKTION BEEINFLUSST DEN ER-EXPORT DES
REZEPTORS UND DESSEN LIGANDEN 115
4.6 DIE KLEINE RETROMER-UNTEREINHEIT IN PFLANZEN BESTEHT AUS EINEM
HETERODIMER 116
4.7 DIE REZEPTOR-LIGANDEN-LNTERAKTION FINDET BEREITS IM ER STATT 117
4.8 DAS RETROMER REZYKLIERT DEN VSR ZURUECK ZUM ER 120
5 LITERATURVERZEICHNIS 124
6 ANHANG 138
6.1 GERAETE 138
6.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN 139
6.3 CHEMIKALIEN 139
6.4 ENZYME UND KITS 139
7 SYMBOLE UND ABKUERZUNGEN 140
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