Epigenetische DNA-Methylierung des HERV-W-Promotors bei abnormaler humaner Plazentogenese und Tumorgenese:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2011
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ZUSAMMENFASSUNG
............................................................................................
VIII
SUMMARY
...................................................................................................................
X
1
EINLEITUNG
..........................................................................................................
1
1.1
PLAZENTOGENESE
......................................................................................
1
1.1.1
UEBERBLICK
DER
VERSCHIEDENEN
PLAZENTATYPEN
...............................................................................................
1
1.1.2
HUMANE
PLAZENTOGENESE
...............................................................................................................................
3
1.1.2.1
VON
DER
OVULATION BIS
ZUR
GASTRULATION
............................................................................................
3
1.1.2.2
HUMANE
PLAZENTOGENESE
....................................................................................................................
5
1.1.2.3
TROPHOBLASTENDIFFERENZIERUNG
-
DER
VILLOESE
TROPHOBLAST
................................................................
6
1.1.2.4
TROPHOBLASTENDIFFERENZIERUNG
-
DER
SYNCYTIOTROPHOBLAST
...............................................................
7
1.1.2.5
TROPHOBLASTENDIFFERENZIERUNG
-
DER
INTERSTITIELLE
EXTRAVILLOESE
TROPHOBLAST
..................................
9
1.1.2.6
TROPHOBLASTENDIFFERENZIERUNG
-
DER
ENDOVASKULAERE
EXTRAVILLOESE
TROPHOBLAST
..............................9
1.2
HUMANE
ENDOGENE
RETROVIREN
...................................................................................................................
10
1.2.1
PLAZENTASPEZIFISCHE
HERVS
........................................................................................................................
13
1.2.2
NICHT-PLAZENTASPEZIFISCHE
HERVS
.............................................................................................................
16
1.3
PLAZENTARE
SYNDROME
....................................................................................................................................
17
1.3.1
INTRAUTERINE
WACHSTUMSRESTRIKTION
.............................................................................................................
17
1.3.2
PRAEEKLAMPSIE
................................................................................................................................................
18
1.3.3
HELLP
.........................................................................................................................................................
18
1.3.4
PLAZENTARE
SYNDROME
UND
HERVS
.............................................................................................................
19
1.4
GESTATIONSBEDINGTE
TROPHOBLASTENERKRANKUNGEN
...................................................................................
19
1.5
DAS
ENDOMETRIALKARZINOM
..........................................................................................................................
20
1.6
ZELLFUSION
.......................................................................................................................................................
22
1.6.1
DER
ZELLFUSIONSPROZESS
................................................................................................................................
22
1.6.2
ZELLFUSIONEN
UND
HERVS
...........................................................................................................................
23
1.7
EPIGENETIK
......................................................................................................................................................
25
1.7.1
DNA-METHYLIERUNG
.....................................................................................................................................
26
1.7.2
HISTONMODIFIKATION
.....................................................................................................................................29
1.7.3
EPIGENETISCHE
REGULATION
VON
HERVS
......................................................................................................30
2
ZIELSETZUNG
...................................................................................................
32
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.............................................................................
33
3.1
MATERIAL.................................................................................................................................................
33
3.1.1
CHEMIKALIEN,
BIOCHEMISCHE
REAGENZIEN
...................................................................................................
33
3.1.2
ENZYME
UND
KITS
.........................................................................................................................................
34
3.1.3
PUFFER
UND
LOESUNGEN
...................................................................................................................................
35
3.1.4
PHARMAKOLOGISCHE
INHIBITOREN
UND
AKTIVATOREN
........................................................................................37
3.1.5
MEDIEN
UND
REAGENZIEN
FUER
DIE
ZELLKULTUR
................................................................................................
37
3.1.6
OLIGONUKLEOTIDE
...........................................................................................................................................
37
3.1.7
PLASMIDE
.......................................................................................................................................................
39
3.1.8
ANTIKOERPER
....................................................................................................................................................
39
3.1.9
ZELLLINIEN
......................................................................................................................................................
39
3.1.10
E.
COLI
STAEMME
............................................................................................................................................
40
3.1.11
GERAETE,
SOFTWARE
UND
SONSTIGE
MATERIALIEN
...............................................................................................
40
3.2
METHODEN
.......................................................................................................................................................
41
3.2.1
PATIENTINNEN
UND
PROBENGEWINNUNG
..........................................................................................................
41
3.2.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
................................................................................................................
42
3.2.2.1
TRANSFORMATION VON
E.
COLI
.............................................................................................................
42
3.2.2.2
KULTIVIERUNG
UND
LAGERUNG
VON
BAKTERIEN
....................................................................................
42
3.2.2.3
PLASMIDISOLIERUNGEN
........................................................................................................................42
3.2.2.4
RNA
EXTRAKTION
AUS
ZELLEN
UND
GEWEBEN
....................................................................................
43
3.2.2.5
DNASEL
BEHANDLUNG
VON
RNA
.......................................................................................................
43
3.2.2.6
DNA
EXTRAKTION
AUS
ZELLEN
UND
GEWEBE
......................................................................................
44
3.2.2.7
DNA
EXTRAKTION
AUS
AGAROSEGELEN
...............................................................................................
44
3.2.2.8
PHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
VON
RNA
UND
DNA
KONZENTRATIONEN
...........................................
44
3.2.2.9
REVERSE
TRANSKRIPTION
.....................................................................................................................
45
3.2.2.10
SEMIQUANTITATIVE
REAL-TIME-PCR
..................................................................................................
45
3.2.2.11
ABSOLUTQUANTITATIVE
REAL-TIME-PCR
.............................................................................................
47
3.2.2.12
BISULFITBEHANDLUNG
GENOMISCHER
DNA
..........................................................................................
48
3.2.2.13
METHYLIERUNGSSPEZIFISCHE
PCR
.......................................................................................................50
3.2.2.14
STRATACLONING
FUER
SEQUENZIERUNG
....................................................................................................
51
3.2.2.15
SEQUENZIERUNG
.................................................................................................................................
52
3.2.3
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
..........................................................................................................................
53
3.2.3.1
KULTIVIERUNG
HUMANER
CHORIONKARZINOM-ZELLLINIEN
JAR,
JEG-3
UND
BEWO
..................................
53
3.2.3.2
ISOLIERUNG
UND
KULTIVIERUNG
HUMANER
TROPHOBLASTEN
...................................................................
53
3.2.3.3
VITALITAETSFAERBUNG
VON
CT
MITTELS
TRYPANBLAU
................................................................................
56
3.2.3.4
FACS
ANALYSE
.................................................................................................................................
56
3.2.3.5
PAPPENHEIM
FAERBUNG
.......................................................................................................................
57
3.2.3.6
ZELLMEMBRANFAERBUNG
.......................................................................................................................
57
3.2.3.7
EINBETTEN
DER
PLAZENTAPROBEN
IN
PARAFFIN
......................................................................................
58
3.2.3.8
FAST
RED
FAERBUNG
.............................................................................................................................
58
3.2.3.9
HAEMATOXILIN-EOSIN
FAERBUNG
............................................................................................................59
3.2.3.10
BESTIMMUNG
DES
ZELLFUSIONSINDEX
..................................................................................................
59
3.2.3.11
BESTIMMUNG
DER
KERNZAHL
PRO MM
SCT
IM
PARAFFINSCHNITT
.........................................................59
3.2.3.12
BILDAUFNAHME
UND
BILDBEARBEITUNG
................................................................................................
60
3.2.4
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
................................................................................................................60
3.2.4.1
PROTEINEXTRAKTION AUS
ZELLEN UND
GEWEBEN
....................................................................................
60
3.2.4.2
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
.................................................................................................
61
3.2.4.3
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
..........................................................................................
61
3.2.4.4
WESTERN
BLOT
.....................................................................................................................................
62
3.2.4.5
STRIPPEN
DER
PVDF
MEMBRAN
..........................................................................................................
63
3.2.4.6
COOMASSIE
FAERBUNG
VON
PROTEINGELEN
............................................................................................
63
3.2.4.7
IMMUNFLUORESZENZ
VON
TROPHOBLASTEN
...........................................................................................
63
3.2.4.8
HCG
ELISA
......................................................................................................................................
64
3.2.4.9
IN
VITRO
METHYLIERUNG
.......................................................................................................................64
3.2.4.10
TRANSFEKTION
MIT
JETPEI
...................................................................................................................
65
3.2.4.11
LUZIFERASE
UND
B-GAL
GENREPORTER
ASSAY
.......................................................................................
65
3.2.5
STATISTISCHE
AUSWERTUNG
UND
DARSTELLUNG
DER
ERGEBNISSE
.......................................................................
66
4
ERGEBNISSE
.....................................................................................................
67
4.1
WEITERENTWICKLUNG
DER
TROPHOBLASTENAUFREINIGUNG
.............................................................................
67
4.2
VERAENDERTES
ZELLFUSIONSVERHALTEN
KORRELIERT
MIT
EINER
VERMINDERT
HERV-HUELLGENE
EXPRESSION
IN
IUGR
..............................................................................................................................................................
71
4.2.1
KLINISCHE
DATEN
DER
UNTERSUCHTEN
PATIENTINNENKOHORTE
............................................................................
71
4.2.2
HERV
ENV
GENEXPRESSIONSPROFIL
IM
PLAZENTAGEWEBE
.............................................................................
72
4.2.3
HERV
ENV
GENEXPRESSIONSPROFIL
IN
ISOLIERTEN
TROPHOBLASTEN
.................................................................
75
4.2.4
VERAENDERTES
FUSIONSVERHALTEN
IN
LUGR-PLAZENTEN
....................................................................................
77
4.2.5
VERAENDERTES
FUSIONSVERHALTEN
IN
ISOLIERTEN
IUGR-TROPHOBLASTEN
..........................................................
78
4.3
METHYLIERUNGSPROFIL
DER
5
LTR
VON
HERV-W
IN
PLAZENTA
...................................................................
80
4.3.1
METHYLIERUNGSSPEZIFISCHE
PCR
(MSP)
.......................................................................................................
80
4.3.2
SEQUENZIERUNG
DER
5
LTR
NACH
BISULFITBEHANDLUNG
-
PLAZENTAGEWEBE
..................................................
82
4.3.3
SEQUENZIERUNG
DER
5
LTR
NACH
BISULFITBEHANDLUNG
-
TROPHOBLASTEN
....................................................
83
4.4
EFFEKTE
VON
5
AZA-2-DESOXYCYTIDIN
UND
TRICHOSTATIN
A
AUF
DIE
SYNCYTIN-1
EXPRESSION
................
84
4.4.1
5 AZA-2-DESOXYCYTIDIN
-
BEHANDLUNG
VON
TROPHOBLASTENZELLLINIEN
.....................................................
84
4.4.2
TRICHOSTATIN
A
-
BEHANDLUNG
VON
TROPHOBLASTENZELLLINIEN
......................................................................
85
4.4.3
KOMBINIERTE
AZA
UND
TSA
BEHANDLUNG
VON
TROPHOBLASTENZELLLINIEN
...............................................
86
4.4.4
EFFEKTE
DER
AZA-BEHANDLUNG
AUF
DEN
FUSIONINDEX
.................................................................................
88
4.4.5
HEMMUNG
DER
SYNCYTIN-1
PROMOTORAKTIVITAET
DURCH
METHYLIERUNG
..........................................................
89
4.5
GENEXPRESSIONSPROFIL
VON
METHYLTRANSFERASEN
UND
METHYLBINDEPROTEINEN
IN
IUGR
UND
KONTROLL
CTS
..................................................................................................................................................................
91
4.6
METHYLIERUNGSPROFIL
VON
SYNCYTIN-1
IM
ENDOMETRIALKARZINOM
-------------------------------------------
92
5
DISKUSSION
.......................................................................................................
94
5.1
REDUKTION
DER
HERV-HUELLGEN
EXPRESSION
KORRELIERT
MIT
VERMINDERTEN
FUSIONSINDEX
IN
IIJGR.
94
5.1.1
REDUKTION
DER
HERV-HUELLGEN
EXPRESSION IN
IUGR
..............................................................................
94
5.1.2
UNVERAENDERTE
EXPRESSION
DER
SYNCYTIN-1
REZEPTOREN
ASCT-1
UND
ASCT-2
IN
IUGR
........................
99
5.1.3
ABNAHME
DER
EXPRESSION
DES
SYNCYTIN-2
REZEPTORS
MFSD2
................................................................
100
5.1.4
ENVW(XQ22.3)
ZEIGTE
GERINGE
EXPRESSION
IN
DER
PLAZENTA
...................................................................
101
5.2
EPIGENETISCHE
REGULATION
DER
SYNCYTIN-1
EXPRESSION
..........................................................................
102
5.2.1
HYPERMETHYLIERUNG
DER
5
LTR
VON
HERV-W
KORRELIERT
MIT
VERMINDERTEN
SYNCYTIN-1
EXPRESSION
IN
PATHOLOGISCHEN
PLAZENTEN
.........................................................................................................................
102
5.2.2
DIE
BEHANDLUNG
VON
ZELLLINIEN
MIT
5 AZA-2
DESOXYCYTIDIN
ERHOEHT
DIE
SYNCYTIN-1
EXPRESSION
UND
DEN
FUSIONSINDEX
......................................................................................................................................
107
5.2.3
SYNCYTIN-2
UND
SYNCYTIN-3
MODULIEREN
DAS
FUSIONSVERHALTEN
............................................................
109
5.2.4
TRICHOSTATIN
A
WIRKT
INDIREKT
AUF
DIE
GENEXPRESSIONS
DER
SYNCYTINE
...................................................
111
5.3
UEBEREXPRESSION
VON
SYNCYTIN-1
IM
ENCA
KORRELIERTE
MIT
EINER
HYPOMETHYLIERUNG
DER
5
LTR
VON
HERV-W
......................................................................................................................................................
113
5.4
AUSBLICK
115
6
LITERATURVERZEICHNIS
..............................................................................
117
7
ANHANG
............................................................................................................
137
7.1
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
..............................................................................................................................
137
7.2
DANKSAGUNG
..................................................................................................................................................
142
7.3
LEBENSLAUF
...................................................................................................................................................
144
7.4
PUBLIKATIONEN
..............................................................................................................................................
145
7.5
KONGRESSBEITRAEGE
UND
PREISE
....................................................................................................................
145
7.5.1
POSTERPRAESENTATIONEN
......................................................................................................................................
145
7.5.2
VORTRAEGE
....................................................................................................................................................
146
7.5.3
PREISE
.......................................................................................................................................................
146
7.6
ERKLAERUNG
..................................................................................................................................................
147
|
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