In-vitro-Selektion und molekulare Charakterisierung Tigecyclin-resistenter Mutanten von Escherichia coli:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Aachen
Shaker
2011
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| Schriftenreihe: | Berichte aus der Pharmazie
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INHALT
INHALT I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS V
1 EINLEITUNG 1
1.1 TETRACYCLINE 3
1.2 TETRACYCLIN-RESISTENZMECHANISMEN 6
1.2.1 TETRACYCLIN SPEZIFISCHER EFFLUX 7
1.2.2 INHIBITOREN DER TET-EFFLUXPUMPEN 9
1.2.3 RIBOSOMALE SCHUTZPROTEINE 10
1.2.4 VERAENDERUNG DER ZIELSTRUKTUREN 12
1.2.5 ENZYMATISCHEINAKTIVIERUNG 13
1.3 *MULTIDRUG RESISTANCE (MDR)-EFFLUXPUMPEN 14
1.4 REGULATION VON MDR-EFFLUXPUMPEN 19
1.4.1 LOKAL 20
1.4.2 GLOBAL 21
1.4.2.1 DAS MOR/MB-OPERON 21
1.4.2.2 DASSOXFIS-OPERON 23
1.4.2.3 DER REGULATOR ROB 24
1.4.2.4 DER REGULATOR RAMA 25
1.5 TIGECYCLIN, ERSTER VERTRETER DER GLYCYLCYCLINE 26
1.6 TIGECYCLIN UND RESISTENZ 29
1.7 ZIEL DER ARBEIT 33
2 MATERIAL 34
2.1 BAKTERIENSTAEMME 34
2.2 SELEKTIONSMUTANTEN 35
2.3 PLASMIDE 42
2.4 OLIGONUKLEOTIDE 43
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/1010036807
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
UE INHALT
2.5 NAEHRMEDIEN UND NAEHRBOEDEN 44
2.5.1 X-GAL/IPTG AGARPLATTEN 45
2.6 VERWENDETE KITS 47
2.7 PUFFER UND LOESUNGEN 48
2.8 ENZYME 49
2.9 ANTIBIOTIKA 49
2.10 GROESSENMARKER FUER DNA 50
2.11 CHEMIKALIEN 51
2.12 GERAETE UND SONSTIGE MATERIALIEN 53
2.13 SOFTWARE 56
3 M E T H O D EN 58
3.1 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 58
3.1.1 HERSTELLUNG VON UEBERNACHTKULTUREN (UNK) 58
3.1.2 HERSTELLUNG UND VERWENDUNG VON DAUERKULTUREN 58
3.1.3 BESTIMMUNG DER LEBENDKEIMZAHL 58
3.1.4 BESTIMMUNG DER MUTATIONSFREQUENZ 59
3.1.5 BESTIMMUNG DER MINIMALEN HEMMKONZENTRATION (MHK) 59
3.1.5.1 MODIFIKATIONEN DES STANDARDPROTOKOLLS 60
3.1.6 IN-VITRO-SELEKTION RESISTENTER KEIME 61
3.1.7 STABILITAETSTEST DER SELEKTIERTEN MUTANTEN 62
3.1.8 UNTERSUCHUNG DER PLASMIDCODIERTEN RESISTENZ 63
3.1.9 KOMPLEMENTATIONSVERSUCHE 63
3.1.10 BESTIMMUNG EINER WACHSTUMSKURVE 64
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 65
3.2.1 GEWINNUNG BAKTERIELLER GENOMISCHER DNA: KOCHMETHODE 65
3.2.2 GEWINNUNG VON PLASMID-DNA 65
3.2.2.1 ALKALISCHE LYSE 66
3.2.2.2 PLASRNID-MINI-PRAEPARATION MITTELS HIYIELD* PLASMID MINI KITS DER
FIRMA REAL BIOTECH
CORPORATION *. 66
3.2.2.3 PLASMID-MINI-PRAEPARATION MITTELS PUREYIELD* PLASMID MINIPREP
SYSTEMS DER FIRMA
PROMEGA 67
3.2.3 PHENOL-CHLOROFORM-FAELLUNG 68
IMAGE 3
3.2.4 ALKOHOLPRAEZIPITATION 68
3.2.5 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 69
3.2.6 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR (QRT-PCR) 72
3.2.6.1 RNA-ISOLIERUNG 72
3.2.6.2 CDNA-SYNTHESE 73
3.2.6.3 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR 75
3.2.7 AUFTRENNUNG VON DNA MITTELS GELELEKTROPHORESE 79
3.2.8 AUFREINIGUNG UND ISOLIERUNG VON DNA 80
3.2.8.1 ENZYMATISCHE AUFREINIGUNG 80
3.2.8.2 AUFREINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN MITTELS SILIKA-SAEULEN 80
3.2.8.3 ISOLIERUNG UND AUFREINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN
81
3.2.9 MODIFIZIERUNG VON DNA 81
3.2.9.1 ENZYMATISCHE SPALTUNG VON DNA 81
3.2.9.2 AUFFUELLUNG VON DNA-ENDEN MIT DEM KLENOW-FRAGMENT 83
3.2.9.3 LIGATIONVON DNA-FRAGMENTEN 84
3.2.10 HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIENZELLEN UND TRANSFORMATION 85
3.2.10.1 CALCIUMCHLORID-METHODE 86
3.2.10.2 ELEKTROPORATION 87
3.2.11 SEQUENZIERUNG 88
3.2.11.1 SEQUENZIERUNG MIT DEM GENOMELAB* GEXP GENETIC ANALYSIS SYSTEM
88
3.2.11.2 SEQUENZIERUNG MIT ABI PRISMTM 310 90
4 ERGEBNISSE 92
4.1 KONSTRUKTION DES MOSAIKPLASMIDS PHPKB13-L.LF 92
4.2 HERSTELLUNG DER AUSGANGSSTAEMME FUER DIE SELEKTION 94
4.3 CHARAKTERISIERUNG DER IN-VITRO AUS DEN SELEKTIONSEXPERIMENTEN
ERHALTENEN
MUTANTEN 97
4.3.1 BESTIMMUNG DER EMPFINDLICHKEIT GEGENUEBER DOXYCYCLIN UND TIGECYCLIN
97
4.3.2 BESTIMMUNG DER STABILITAET DER SELEKTIERTEN MUTATIONEN 100
4.4 UNTERSUCHUNG DER MUTANTEN AUF MOEGLICHE CHROMOSOMALE MUTATIONEN 102
4.4.1 TARGETMUTATIONEN DER 16S RRNA 102
4.4.2 *MULTIDRUG-RESISTANCE (MDR)-EFFLUXPUMPEN 104
4.4.2.1 BESTIMMUNG DER EMPFINDLICHKEIT IN ANWESENHEIT EINES
EFFLUXPUMPENINHIBITORS 104
4.4.2.2 PCR AUF WICHTIGE REGULATOREN VON UNSPEZIFISCHEM EFFLUX {MARR,
SOXR, ACRR) 106
4.4.2.3 SEQUENZIERUNG VON MARR 109
IMAGE 4
J V INHALT
4.4.2.4 MARR-KOMPLEMENTATION 111
4.4.2.5 EXPRESSIONSSTATUS VON MARA 113
4.4.2.6 SEQUENZIERUNG VON ACRR UND SOXR BEI DER MUTANTE S52 119
4.5 UNTERSUCHUNG DER MUTANTEN AUF MOEGLICHE PLASMIDCODIERTE MUTATIONEN
119
4.5.1 CHARAKTERISIERUNG DER TRANSFORMANDEN 120
4.5.2 UNTERSUCHUNG DER MUTANTEN AUF MOEGLICHE VERAENDERUNGEN VON TETB 125
4.5.2.1 SEQUENZIERUNG VON TETB 125
4.5.2.2 EXPRESSIONSSTATUS VON TETB 126
4.5.3 UNTERSUCHUNG DER MUTANTEN AUF MOEGLICHE VERAENDERUNGEN VON TETM 128
4.5.3.1 SEQUENZIERUNG VON TETM 129
4.5.3.2 EXPRESSIONSSTATUS VON TETM 132
5 DISKUSSION 135
5.1 SELEKTION VON IN-VITRO MUTANTEN 135
5.2 BESTIMMUNG DER EMPFINDLICHKEIT 138
5.3 STABILITAET DER MUTATIONEN 140
5.4 CHARAKTERISIERUNG DER CHROMOSOMALEN MUTATIONEN 141
5.4.1 MUTATIONEN IN DER ZIELSTRUKTUR 141
5.4.2 MDR-EFFLUX 142
5.5 CHARAKTERISIERUNG DER PLASMIDCODIERTEN MUTATIONEN 152
5.5.1 TETB 156
5.5.2 TETM 158
5.6 AUSBLICK 160
ZUSAMMENFASSUNG 163
SUMMARY 165
LITERATUR 167
GEFAHRSTOFFLISTE 181
DANKSAGUNG 185
LEBENSLAUF 187
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